روش تهیه معرف های VP

- تهیه آلفا نفتول (معرفA):

پودرآلفا نفتول: g 5

اتانول: cc100

-تهیه  KOH(پتاس) (معرفB):

KOH:g 40

کراتین (cr): g 3/0

آب‌مقطر: cc100

معرف ها در ظروف تیره و در یخچال نگهداری می‌شوند. چون دارای پایداری متغیر هستند لازم است به طور هفتگی (بر حسب میزان کار) کنترل کیفی گردند.

روش تهیه معرف متیل رد (MR)

پودر متیل رد= g 1/0

اتانول=cc 300

پودر متیل رد را در اتانول حل کرده سپس با آب‌ مقطر حجم آنرا به cc500 برسانید. معرف در ظرف تیره و در یخچال نگهداری می‌شود. چون دارای پایداری متغیر است، لازم است بطور هفتگی (بر حسب میزان کار) کنترل کیفی گردد.

روش تهیه معرف کواکس

P-دی متیل آمینو بنز آلدئید= g10

آمیل الکل: cc150

اسید کلریدریک غلیظ و تازه: cc50

دی متیل آمینو بنزآلدئید را به آمیل الکل اضافه نموده و به آرامی اسید کلریدریک را به آنها اضافه نمایید. برای تهیه این معرف از هود استفاده نمایید. معرف در ظروف تیره و در یخچال نگهداری می شود. چون دارای پایداری متغیر است، لازم است بطور هفتگی (برحسب میزان کار) کنترل کیفی گردد.

روش تهیه معرف کلرور فریک

کلرور فریک= g10

آب‌ مقطر = cc100 (روش غیر اسیدی)

(روش دیگر تهیه این معرف شامل کلرور فریک:g 12، اسید کلریدریک غلیظ:cc 5/2 و آب ‌مقطرcc 100 می‌باشد، که این روش، روش اسیدی است). معرف در ظروف تیره و در یخچال نگهداری می‌شود. چون دارای پایداری متغیر است، لازم است بطور هفتگی (برحسب میزان کار) کنترل کیفی گردد.

روش تهیه معرف های احیاء نیترات

-تهیه معرف A:

N،N  دی متیل آلفا نفتیل آمین: g6

 اسیداستیک گلاسیالN5، (30% )cc :1000

 مقدار فوق از N، N دی متیل آلفا نفتیل آمین را در کمتر از cc1000 اسید استیک گلاسیال N5 حل کرده و کمی حرارت ملایم دهید تا حل شود. حجم را به یک لیتر رسانیده، محلول را از صافی رد کنید.

-تهیه معرف B:

سولفانیلیک اسید (P- آمینو بنزن سولفونیک اسید): g8

اسیداستیک گلاسیال N5، (30% ): cc 1000

مقدار فوق از سولفانیلیک اسید را در کمتر از cc 1000 اسیداستیک حل کرده و سپس حجم را به یک لیتر برسانید. معرف ها در ظروف تیره و در یخچال نگهداری می شوند. آلفا نفتیل آمین سرطان زا است.

روش تهیه معرف نین هیدرین

پودر نین هیدرین=  g5/3

استن=  cc50

بوتانول =  cc50   

استن و بوتانل را مخلوط کرده و سپس پودر نین هیدرین را اضافه نمایید. معرف در ظرف تیره و در دمای اتاق نگهداری می شود. درب آن باید کاملاً محکم بسته شود.

روش تهیه ویتامین K₁

پودر ویتامین  =k₁ g2/0

اتانول= cc20

محلول در ظرف تیره و در یخچال نگهداری می‌شود. درب ظرف باید کاملاً محکم بسته شود. غلظت نهایی محلول g/mlµ 1/0 برای محیط های مایع و g/mlµ10 برای محیط های آگاردار است. g2/0 پودر ویتامین K₁ را روی یک قطعه کوچک فویل آلومینیومی استریل وزن کرده و در شرایط آسپتیک به ml20 اتانول در یک بطری استریل اضافه کنید. برای رقیق سازی بیشتر از آب‌ مقطر استریل استفاده کنید. محلول ذخیره  mg/ml10 است. ml1 از محلول ذخیره را به یک لیتر آگار و ml/l 01/0 براث اضافه کنید. محلول را دور از نور و در یخچال ذخیره کنید.

روش تهیه همین(Haemine)

پودر همین= g 5/0    

سود (NaOH)N 1= cc10

مقدار فوق از پودر همین را به cc10سود 1 نرمال اضافه کرده و حل کنید، سپس با آب ‌مقطر به حجم cc100برسانید. در شرایط 15 دقیقه، ^oC121، فشار  Lb15 در اتوکلاو استریل ‌نمایید.

محلول در ظرف تیره و در یخچال نگهداری می شود. این محلول ذخیره mg/ml 5 غلظت دارد، ولی هنگام مصرف به عنوان ساپلمنت، باید دارای غلظت نهایی µg/ml 5 باشد.

روش تهیه آب اکسیژنه (H₂O₂) 3%

محلول آب اکسیژنه 30% را به نسبت 1:10 با آب ‌مقطر رقیق نمایید. (یعنی cc1 آب اکسیژنه 30% را به cc9 آب‌مقطر اضافه ‌نمایید). محلول در ظرف تیره و در یخچال نگهداری می شود.

روش تهیه کریستال ویوله ذخیره و اگزالات آمونیوم ذخیره

-تهیه کریستال ویوله

پودر کریستال ویوله = g20

اتانول= cc100

-تهیه اگزالات آمونیوم

پودر اگزالات آمونیوم= g1

آب‌ مقطر= cc100

هنگام مصرف، محلول کریستال ویوله ذخیره را به نسبت 1:10 با آب‌ مقطر رقیق ‌نمایید.
(cc1 از محلول کریستال ویوله و cc 9 آب‌ مقطر) سپس این محلول را با چهار حجم از
محلول اگزالات آمونیم رقیق کنید (cc1 محلول کریستال ویوله رقیق شده و cc4 اگزالات آمونیم).

محلول ذخیره و مصرفی کریستال ویوله، در ظرف تیره و در دمای اتاق نگهداری می‌شود.

روش تهیه لوگل

ید= g1

یدور پتاسیم =g 2

آب ‌مقطر= cc240

محلول آبی بیکربنات سدیم5%= cc60

در مقدار کمی از آب‌ مقطر، ید و یدور پتاسیم را کاملاً حل نمایید، بعد حجم را با آب‌ مقطر به cc240‌ برسانید. محلول 5% بیکربنات سدیم (بیکربنات سدیم: g5   آب ‌مقطر: c100) را نیز به آن اضافه ‌نمایید. محلول در دمای اتاق نگهداری می شود . درب آنرا باید کاملا" محکم ببندید.

روش تهیه محلول الکل-استون

اتانول= cc250

استون= cc250

حجم مساوی از الکل اتیلیک (اتانول) را با استون مخلوط نمایید.

روش تهیه فوشین/ یا سافرانین ذخیره

پودر فوشین= g2

اتانول= cc100

و یا

پودر سافرانین= g5/2

اتانول= cc100

به هنگام مصرف، محلول ذخیره فوشین یا محلول ذخیره سافرانین را به نسبت 1:10 با آب‌ مقطر رقیق نمایید. محلولها در ظروف تیره، تهیه و در دمای اتاق ذخیره می شوند.

1-        هدف: 

تهیه محیط های کشت استریل جهت رشد و جداسازی سویه های میکروبی از نمونه های مربوط به بیمار

2-      تعاریف و اصطلاحات:

شرایط آسپتیک: ایجاد شرایط سترون با کار کردن در کنار شعله و رعایت نکات لازم جهت جلوگیری از آلودگی نمونه

3-      شرح اقدامات:

3-1)  آب:

آب مورد استفاده باید دارای کیفیت مناسب باشد، یعنی عاری از موادی باشد که می توانند از رشد میکروارگانیسم ها جلوگیری کنند (یونهای فلزی سمی مثل مس) یا در شرایط آزمایش بر رشد آنها تاثیر بگذارند. آب خوب و تازه باید از راه تقطیر یا دیونیزاسیون تهیه شود. برای نگهداری آب مقطر باید از ظروفی استفاده شود که از مواد خنثی تهیه شده اند (شیشه خنثی، پلی اتیلن و غیره). ضریب هدایت آب باید کمتر از μs 15 باشد.pH  آب معمولا" کنترل نمی  شود مگر آنکه مشکلی در pH محیط های کشت تهیه شده بوجود آید. ممکن است آب دارای مقادیر زیادی میکروارگانیسم باشد، بنابراین توصیه می شود از آبی استفاده شود که تعداد میکروارگانیسم آن کم است .

سِل به زبان فارسی دری «توبر کلوز» یک بیماری واگیردار است. باسیل این بیماری میکوباکتریوم توبرکلوزیس یا باسیل کخ نام دارد زیرا که در سال ۱۸۸۲ (میلادی) پرفسور رابرت کخ دانشمند آلمانی آن را کشف کرد. نوعی از این بیماری که به سل گاوی موسوم است، میان انسان و چهارپایان مشترک است.

این بیماری در کشورهای جهان سوم از معضلات بهداشتی است. مرض سل یا توبرکلوز (به اختصار تی‌بی) یکی از بیماریهای مهلک در جهان است که عامل آن مایکوباکتریوم‌ها یا به طور دقیقتر میکوباکتریوم‌های سلی است. در بیماری سل معمولاً ششها مورد حمله قرار می‌گیرند، این نوع سل را تی‌بی ریوی نیز گویند ولی از سایر اعضای درگیر در سل می‌توان سیستم عصبی مرکزی، غدد لنفاوی و گردش خون، دستگاه تناسلی و ادراری، دستگاه گوارش و معده، استخوان‌ها، مفاصل و پوست را نام برد. سایر میکوباکتریوم‌ها مانند بوویس، افریکنم، میکرتی و کانتی نیز باعث بیماری می‌شوند ولی نادر هستند. از انواع نشانه‌های سل می‌توان به سرفه مزمن همراه با خلط سینه آغشته به خون، تب، تعریق شبانگاهی و کاهش وزن اشاره کرد. سل را می‌توان با رادیوگرافی قفسه سینه، تست پوستی توبرکولین، بررسی میکروسکوپی خلط و کشت میکروبی خلط و مایعات بدن در آزمایشگاه تشخیص داد.

درمان سل مشکل است و به دوره‌های طولانی و استفاده از آنتی بیوتیک‌های متفاوت نیاز دارد همچنین باید رفتار و تماس افراد کنترل شود. گونه‌های مقاوم به آنتی بیوتیک مایکوباکتریوم در سال‌های اخیر درمان سل را با مشکل روبه رو کرده‌است.

دانشگاه علوم پزشکی مشهد در نظر دارد ششمین کنگره میکروب شناسی بالینی ایران را در تاریخ 11 لغایت 13 مهر ماه سال 1391 در مشهد برگزار نماید .
این کنگره پذیرای مقالات اساتید ، دانشجویان و پژوهشگران گرامی در زمینه های مختـلف میـکروب شنـاسی بالیـنی به شرح زیر می باشد.

محورهای کنگره

مقاومت آنتی میکروبی
بهداشت دست
عفونت بیمارستانی- باکتری شناسی بالینی 
قارچ شناسی بالینی 
ویروس شناسی بالینی 
انگل شناسی بالینی 
ایمنی شناسی بیماریهای عفونی
بیماریهای مشترک انسان و دام
مقاومت های دارویی
واکسیناسیون 
سل و مقاومت دارویی
و .... 

مقدمه

همانگونه که می دانیم هلیکوباکتر پیلوری ( Helicobacter pylori ) یک باکتری پاتوژن انسانی است که در معده انسان کلونیزه می شود. عفونت با این باکتری در کشورهای در حال توسعه بیشتر دیده شده و افراد غالباً در سنین پایین به این باکتری آلوده می شوند. در این جریان، فاکتورهای مختلفی از جمله شرایط اقتصادی – اجتماعی ، بهداشت فردی ، آگاهی مردم و ... نقش مهمی را ایفا می کنند. راه های انتقال باکتری متفاوت است ولی تحقیقات متعدد نشان می دهد که ارگانیــسم عمدتاً در اثر تماس مستقیم ( شخص به شخص ) در درون خانواده صورت می گیرد. در این میان، انتقال بین نوزادان شیرخوار بیشتر از کودکان و نوجوانان می باشد. همچنین آقای Benner فرضیه انتقال باکتری بین زن و شوهر را نیز مطرح نمود.  از نظر اپیدمیولوژی، عفونت به این باکتری در سرتاسر جهان دیده می شود. طیف علائم بالینی ایجاد شده از گاستریت مزمن تا سرطان معده متفاوت است. سازمان بهداشت جهانی ( WHO ) هلیکوباکترپیلوری را به عنوان عامل کارسینوژن تیپ I معرفی نموده اســـت. باکتری علاوه بر ایجاد بیماری در بافت معده، ممکن است در خارج از دستگاه گوارش نیز به صورت یک پاتوژن عمل کند. در این مقاله به چندین بیماری که ارتباط آن با H.pylori  مشخص شده اشـاره خواهد شد.

مدل سازی رایانه‌ای از هلیکوباکتر پیلوری که در معده انسان زندگی می‌کنند

هلیکوباکتر پیلوری، یک باکتری گرم منفی که در سطح مجرایی پوشش معده دیده می‌شود، اولین بار در سال 1983 توسط وارن (Warren) و مارشال (Marshall) یافت شد . این باکتری التهاب مزمن مخاط زیرین را القا می‌کند. عفونت معمولاً در سال‌های اول عمر کسب می‌شود و در صورت عدم درمان، پایدار می‌ماند. شیوع عفونت در سنین بالاتر و در افرادی که کودکی خود را در وضعیت اجتماعی- اقتصادی پایین سپری کرده‌اند، بیشتر است و بنابراین در نقاط مختلف جهان بسیار گوناگون است. تصور می‌شود شیوع بالاتر در سنین بالاتر، نتیجه اثر همگروهی ناشی از شرایط پایین‌تر زندگی کودکان در دهه‌های گذشته باشد. حداقل 50 جمعیت انسانی جهان، عفونت هلیکوباکتر پیلوری دارند. این ارگانیسم قادر است در محیط اسیدی معده زنده بماند. بخشی از این توانایی، محصول فعالیت بسیار بالای اوره‌آزی باکتری است؛ اوره‌آز، اوره موجود در شیره معده را به آمونیاک قلیایی و دی اکسید کربن تبدیل می‌کند.

عفونت با هلیکوباکتر پیلوری، کوفاکتوری در ایجاد سه بیماری مهم دستگاه گوارش فوقانی است: زخم دوازدهه یا معده (که بر اساس گزارش‌ها در 10-1 بیماران آلوده ایجاد می‌شود)، سرطان معده (3-1/0)، و لنفوم بافت لنفویید مخاط معده (MALT) (کمتر از 01/0). خطر این پیامدها در بیماران آلوده در بین جمعیت‌های مختلف گوناگونی زیادی دارد. اکثریت بیماران دچار عفونت هلیکوباکتر پیلوری هرگز دچار عوارض مهم بالینی نخواهند شد.
زخم‌های معده و دوازدهه در بیماران مبتلا به زخم دوازدهه، التهاب مخاط معده ناشی از عفونت، در ناحیه آنتروم معده شدیدتر است. آنتروم معده اسید ترشح نمی‌کند و مسؤول آزادسازی بیشتر گاسترین است. افزایش سطح گاسترین، خود باعث تحریک ترشح اسید از مخاط فوندوسی مترشحه اسید در بخش‌های پروگزیمال‌تر معده می‌گردد که نسبتاً عاری از التهاب هستند. افزایش بار اسید دوازدهه، آسیب مخاط دوازدهه را به دنبال خواهد داشت، و سبب ایجاد زخم و متاپلازی معده‌ای مخاط دوازدهه می‌گردد. متعاقباً مخاط متاپلاستیک می‌تواند با هلیکوباکتر پیلوری کلونیزه شود و این پدیده احتمالاً در فرایند ایجاد زخم نقش دارد. ریشه‌کنی عفونت موجب علاج طولانی‌مدت زخم‌های دوازدهه در بیش از 80 بیمارانی می‌شود که زخم آنها ناشی از مصرف NSAID نبوده است. داروهای گروه NSAID علت عمده زخم‌های منفی از نظر هلیکوباکتر پیلوری هستند.

باور محققین بر این است که زخم معده محصول آسیب مخاطی ناشی از هلیکوباکتر پیلوری است. همانند زخم‌های دوازدهه، ریشه‌کنی عفونت معمولاً بیماری را علاج می‌کند، به شرطی که زخم معده ناشی از NSAID نبوده باشد.

ترماتودهای کبدی غیر شایع در ایران clonorchis sinensis , opisthorchis felineus , o.viverini -

این ترماتودهای کبدی در مجاری صفراوی دیستال و درست در زیر کپسول کبد مستقر می شوند و تنها در عفونت های شدید در مجرای صفراوی مشترک و یا در کیسه صفرا دیده می شوند.نام دیگر کلونورکیس ، کرم کبدی چینی (chinese liver fluke ) و نام دیگر اپیستورکیس ، کرم کبدی گربه  ( cat liver fluke ) است.تمایز این دو جنس با استفاده از شکل بیضه آنها صورت می گیرد.

Clonorchis sinensis  و opisthorchis viverini  غالبا در کشورهای خاور دور از جمله : چین ، تایوان ، ویتنام ، تایلند و کامبوج دیده می شوند و Opisthorchis felineus  در روسیه و اکراین شایع می باشد.سگ ها مخزن اصلی کلونورکیس و گربه های وحشی ،مخزن اصلی گونه های اپیستورکیس می باشند.

مرفولوژی و سیر تکامل

طول کرم های بالغ 10-25 میلی متر و عرض آنها 3-5 میلی متر است.در کلونورکیس ساینسیس (شکل 1)  بیضه ها بسیار منشعب و در اپیستورکیس فلینئوس (شکل 2 ) به صورت لوبوله است.بادکش های دهانی از بادکش شکمی بزرگتر است.

شکل 1

شکل 2

تخم های این انگل ها واجد میراسیدیوم کامل است و وقتی در اب قرار میگیرند به وسیله حلزون میزبان واسط خورده می شوند.پس از خورده شدن تخم ،میراسیدیوم از داخل آن خارج می شود و در دیواره ی روده حلزون نفوذ می کند.سپس به هموسل و از آنجا به غدد هاضمه میرود و در آنجا به اسپوروسیت ، ردی و نهایتا سرکر تمایز می یابد.سرکرها به علت داشتن یک پرده بر روی دم ، لوفوسرکر (lophocercus cercariae ) نامیده می شوند.پس از تشکیل ، حلزون ناقل را ترک می کنند و پس از نفوذ در بدن ماهی های آب شیرین به متاسرکر تبدیل می شوند.گونه های زیادی از ماهی های خانواده cyprinidae  به عنوان میزبان واسط دوم این انگل ها ایفای نقش می کنند.انسان و سایر  میزبانان نهایی ماهیخوار ، با خوردن ماهی های الوده به صورت خام یا کم پخته به این انگل ها مبتلا می شوند.

انواع مختلفی از غذاهای سنتی که با گوشت ماهی تهیه می شوند ، در ابتلای مردم نواحی آندمیک نقش دارند.از ان جمله می توان به sushi  و  sashimi  اشاره نمود.در دئودنوم انسان دیواره خارجی متاسرکر تحت تاثیر تریپسین حل میشود، در حالیکه دیواره داخلی آن در نتیجه فعالیت متاسرکر پاره می شود.لاروهای ازاد شده به مجرای صفراوی مشترک مهاجرت می کنند و از انجا به مجاری صفراوی دیستال در زیر کپسول کبد وارد  و در مدت یک ماه بالغ می شوند.

منبع: کرم شناسی پزشکی / دکتر کیهان اشرفی

باکتری‌های سودوموناس باکتری‌های خاکزی هستند که در خاک سبب ترشح سیدروفور شده و جذب آهن و برخی دیگر از عناصر ریزمغذی نظیر روی را امکان‌پذیر می‌سازد.  باکتریهای جنس سودوموناس، از خانواده Pseudomonadaceae که به شکل میله‌ای راست یا کمی خمیده، دارای تاژک قطبی، بدون اسپور و گرم منفی می‌باشند. این باکتری‌ها هوازی و از نظر منبع انرژی و کربن کموارگانوتروف‌ هستند. از نظر نیازهای غذایی گونه های سودوموناس نیاز غذایی بسیار ساده ای دارند. در شرایط آزمایشگاهی در محیط‌های حاوی مقداری ماده آلی در pH خنثی بخوبی رشد می کنند. از مهمترین این محیطها King'B است. متابولیسم گونه‌های سودوموناس تنفسی بوده وحالت تخمیری ندارند. این باکتریها قادرند از 150 ترکیب آلی بعنوان منبع کربن وانرژی استفاده نمایند. در سالهای گذشته گونه‌های سودوموناس طبق طبقه‌بندی محققین باکتری‌های جنس سودوموناس را بر اساس مطالعات همسانی rRNA/DNA به پنج گروه تقسیم‌بندی کردند. از پنج گروه مذکور اخیرا فقط گروه I در جنس سودوموناس ابقا شده و بقیه در جنسهای جدید ویا موجود قبلی جای گرفته اند. گروه I ، بعنوان بزرگترین گروه انواع فلورسنت را در خود جای داده است. وجه تمایز سودوموناس‌های فلورسنت از سایر سودوموناس‌ها، تولید پیگمانهایی است که در برابر نور طول موج کوتاه فرابنفش (254 نانومتر) بویژه در شرایط کمبود آهن خاصیت فلورسانس دارند. به این پیگمان‌های با خاصیت فلورسنت و محلول در آب سیدروفور (siderophore) و اختصاصاً در مورد سودوموناس‌ها پیووردین یا سودوباکتین گفته می‌شود. از مهمترین گونه های فلورسنت می‌توان به P. fluorescens ، P. putida، P. aeruginosa  و همچنین پاتوژنهای گیاهی نظیر P. syringae  و P. cichorii  اشاره نمود. برای افتراق گونه‌های فلورسنت پاتوژن‌های گیاهی از سایر فلورسنت‌ها از آزمون آرژینین‌دی‌هیدرولاز استفاده می‌شود، که پاتوژن‌های گیاهی آرژینین‌دی‌هیدرولاز منفی می‌باشند. آزمون‌های ذوب ژلاتین، استفاده از قند ترهالوز، رشد در دماهای 41 و 4 درجه سانتی‌گراد از مهمترین شاخص‌های تفکیک گونه‌های P. fluorescens ، P. putida  و P. aeruginosa  است.

این کدوم انگله؟

اریترومایسن ، پنی سیلین ، سولفونامید ، تتراسایکلین ، ونکومایسین و .... جز دسته ای بزرگ از ترکیبات شیمیایی هستند که باعث متوقف کردن رشد باکتریها (باکتریواستاتیک) و یا از بین بردن باکتری ها (باکتریوسیدال) در یک دوز پایین می شوند . در علم میکروب شناسی به این دسته از دارو ها که بروی باکتری ها اثر می گذارند آنتی بیوتیک می گویند . هر دسته از انتی بوتیک ها بر روی باکتری خاصی تاثیر دارد و این دارو ها بر روی ویروس و یا سایر میکروارگانیسم ها تاثیری نخواهند داشت . با این حرفا ،  این سوال در ذهن ایجاد می شود که ما از کجا بدانیم چه آنتی بیوتیکی بر روی چه باکتری هایی موثر است ؟ جواب سوال ما تست آنتی بیوگرام است که به صورت روتین در آزمایشگاه های میکروبیولوژِی انجام می گیرد . این تست به ما نشان می دهد که کدام یک از آنتی بیوتیک ها بر روی میکروب ما موثر است . همانطور که می دانید نمونه های گرفته شده برای بخش میکروبیولوژِی متفاوت هستند . اما نمونه ها هر چی که باشند (خون ، مایع مغزی-نخائی ، مدفوع ، ادرار ، خلط و..) در آخر  معمولا آنتی بیوگرام می شوند تا داروی موثر تجویز شود . در واقع باید بگوئیم که در عفونت های میکروبی آزمایشگاه دارو را تجویز می کند نه پزشک ...

 خلاصه ای از پروسه آنتی بیوگرام دیسک دیفیوژن

بعد از کشت نمونه دریافتی در محیط کشت مناسب ، اگر شرایط مناسب باشد و باکتری در نمونه ما باشد ، باکتری موجود در نمونه رشد خواهد کرد . بعد از رشد باکتری ، از ان لام (مقداری نمونه + سرم فیزیولوژِی) تهیه می کنیم و رنگ آمیزی گرم انجام می دهیم . اگر باکتری ایزوله ما ، جز باکتری های پاتوژن باشد ، باید تست آنتی بیوگرام را انجام دهیم . مقداری از نمونه را برداشته و  در محیط کشت آنتی بیوگرام کشت می دهیم ، سپس دیسک های آنتی بیوگرامی را روی محیط کشت گذاشته و جواب را بعد از ۲۴ ساعت برسی کرده و نتایج را گزارش می کنیم .

• بعد از معرفی ابتدایی آنتی بیوگرام ، وارد بحث تخصصی آزمایشگاهی می شویم .

اصول آنتی بیوگرام

اصول آنتی بیوگرام بر پایه دو اصطلاح میکروب شناسی است یعنی :

• Minimum Inihibitory Concentration (MIC)
• Minimum Bactericidal Concentration (MBC )

منظور از MIC ، غلظتی از یک آنتی بیوتیک است که می تواند رشد باکتری را در شرایط آزمایشگاهی مهار کند. و منظور از MBC ، حداقل غلظتی از دارو است که باکتری را از بین می برد. در اغاز باید بگم که باید آزمایش کننده چهار اصل زیر را قبل از آغاز آنتی بیوگرام مشخص کند :

• Which organisms to test?_{کدام ارگانیسم برای تست}                                                        
•  
• What methods to use?_{کدام روش تست}                                                               
•  
• What antibiotics to test?_{کدام آنتی بوتیک}  
•  
• How to report results? _{چگونگی گزارش نتایج}

روش های مختلف انجام تست تعیین حساسیت داروئی

• Disk diffusion (Kirby Bauer)
• Broth micro-dilution MIC (NCCLS متد رفرنس)
• Etest

وسائل و موارد مورد نیاز برای تست انتی بیوگرام "دیسک دیفیوژن"

1. محیط کشت که آنتی بیوگرام بر روی آن انجام می شود که "آگار مولر هینتون"می باشد .
2. لوله حاوی نیم مک فارلند .
3. لوله حاوی یک سی سی سرم فیزیولوژِی استریل
4. دیسک های انتی بیوگرام
5. باکتری خالص در محیط کشت مناسب
6. سواب ، انس ، شعله ، هود ، چراغ

• محیط نیم مک فارلند

محیط نیم مک فارلند محیطی در تست آنتی بیوگرام است که میزان کدر بودن نمونه خود را با ان مقایسه می کنیم . این محیط حاوی ۱.۵*۱۰^۸ باکتری است . نحوه تهیه این محیط در آزمایشگاه به شرح زیر است :

این محیط به مدت ۶ ماه در تاریکی و در ظرف در بسته که به وسیله اتش بسته شده است می تواند مورد استفاده قرار گیرد . اما با این اوصاف ، اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شد ، محیط غیر قابل استفاده خواهد بود . زمانی که می خواهیم از این محیط استفاده کنیم باید انرا به خوبی حل بزنیم و جهت مقایسه کدورت لوله کشت با لوله مک فارلند، استفاده از یک زمینه سفید با خطوط سیاه و نور کافی توصیه می‌شود این اقدام بویژه جهت باکتریهایی مثل هموفیلوس، گنوکک و پنوموکک که در محیط آبگوشت به خوبی رشد نمی‌کنند توصیه می‌شود.

• روش کار

روش های مختلفی برای تعیین حساسیت باکتری ها به انتی بیوتیک ها وجود دارد اما من در این قسمت تست روتین و ساده دیسک دیفیوژن (Disk diffusion ) را معرفی می کنم .

بعد از ایزوله کردن باکتری ، مقداری از کلونی باکتری را به وسیله انس (نه لوپ) برداشته و در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم . باید در نظر داشت که چون ، در تست آنتی بیوگرام میزان کدر بودن برای ما خیلی مهم است ، بنابراین در انتخاب مقدار نمونه باید دقت کنیم تا نمونه را بیشتر یا کمتر از نیم مک فارلند برنداریم . اگر میزان کدورت کمتر از نیم مکفارلند باشد ، مقداری دیگر از نمونه را در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم و یا اگر میزان کدر بودن ، بیشتر از نیم مک فارلند باشد در این صورت باید مقداری سرم فیزیولوژی استریل اضافه کرد تا به کدورت مناسب و برابر با نیم مک فارلند برسیم . بعد از تهیه محلول هموژن خود ، با سواب استریل محلول را به هم زده و بعد از آبکشی کردن سواب ، (برای آب کشی ، سواب را با قدرت به دیواره لوله تکیه داده و فشار دهید تا آب آن گرفته شود .) آن را به محیط کشت مولر هینتون انتقال می دهیم و به طور کامل به وسیله سواب ، محیط کشت را به صورت چمنی کشت می دهیم به طوری که هیچ محلی در محیط از قلم نیافتد  . بعد از کشت ، دیسک های انتی بیوگرام که قبل از نیم ساعت از تست ، بیرون یخچال قرار داده شده اند را انتخاب و بر روی محیط کشت انتقال می دهیم . باید ذکر کنم که نحوه قرار دادن دیسک ها در محیط کشت مولر هینتون ، به صورت دایره ای  است و فاصله این دیسک ها از هم دیگر حدود 12 میلیمتر باشد و باید از دیواره هم فاصله داشته باشند . در ضمن فاصله این دیسک ها را می توان با توجه به تجربه خود کم و یا زیاد کنیم . دیسک های مورد استفاده هم باید با نوع باکتری ایزوله شده ما مناسب باشد مثلا هیچ وقت برای باکتری گرم منفی ، پنی سیلین قرار نمی دهیم چون نسبت به آن مقاوم هستند و یا اینکه آنتی بیوتیک کلروامفینیکل را برای کشت ادرار قرار نمی دهیم چون این انتی بیوتیک نمی تواند وارد مجاری ادراری شود و... بعد از قرار دادن دیسک ها ، در پلیت را بسته و به مدت 24 ساعت آنها را در دمای 37 درجه سانتیگراد ، انکوبه می کنیم (لازم به ذکر است که بنابه به تحقیقات تازه محقین ، دمای انکوبه برای آنتی بیوگرام به ۳۵ درجه کاهش یافته است و مدت زمان آن هم به ۱۶ تا ۱۸ ساعت کاهش یافته است ) . بعد از 24 ساعت پلیت را زیر چراغ برسی می کنیم  .آنگاه می‌باید قطر هاله عدم رشد را با خط‌کش اندازه گیری کرد و با توجه به جدول همراه دیسک ها ، گزارش تست انتی بیوگرام خود را برای هر یک از انتی بیوتیک ها ، به صورت حساس (Susceptible ) ، مقاوم (Resistant) و یا نیمه حساس (Intermediate) گزارش می شود .

نحوه خواندن و گزارش کردن

بعد از انکوبه ، محیط ما باید به صورت زیر باشد :

همان طور که مشاهده می کنید در اطراف برخی از دیسک ها هاله روش وجود دارد که این نشان دهنده حساس بودن ان بکتری به ان دیسک است و باید حساس گزارش شود . همچنین در اطراف بعضی از دیسکها هیچ گونه هاله ای نیست در این حالت این باکتری را باید نسبت به ان دیسک مقاوم گزارش داد . اگر طبق جدول خود هیچ یک از حالات فوق مشاهده نشود در اینصورت نیمه حساس را گزارش می کنیم .

و چند نکته مهم  :

• در اندازه گیری از خط کش معمولی و یا ویژه این کار استفاده کنید .
• همیشه امتداد خط کش باید از وسط دیسک عبور کند .
• همیشه قطر اندازه گیری می شود .
• باید در تست انتی بیوگرام ، نگاه بدبینانه ای داشت . یعنی اینکه کوتاهترین مسیر را برای تعیین حساسیت انتخاب می کنیم .
• اگر در اطراف دیسک خط هایی کشیده شده باشد در این صورت باید از اخرین خطی که بعد از ان دیگر کلونی نیست تعیین حساسیت کرد.
• اگر در اطراف دیسک حتی یک کلونی هم باشد باید از همان جا تا دیسک را اندازه گیری کرد نه کل هاله را .
• همیشه به محل هاله دقت کنید بازم می گم همیشه و کوتاهترین مسیر ار انتخا کنید .
• دیسک ها و هاله ها را در زیر نور برسی کنید .

 محیط کشت در آنتی بیوگرام

• تست همیشه در زیر هود و در کنار شعله انجام شود .
• باکتری ایزوله شده باید ، خالص رشد کرده باشد .
• در زمان برداشت نمونه باید سعی شود که از یک کلونی برداشت شود .
• قبل از انتقال سواب به محیط کشت مولر هینتون ، محیط کشت را از عدم رشد کلونی های باکتری در محیط کشت مولر هینتون برسی کنیم . اگر کلونی در محیط کشت دیده شد ، محیط را عوض می کنیم .
• همیشه به وسیله انس نموه را برداشته و سپس به لوله حاوی سرم فیزیولوژی استریل اضافه کنید .
• برای اینکه به کدروت مورد نظر نیم مک فارلند دست یابید ، از مقادیر کم کلنی شروع کنید و یا کلونی را ابتدا به دیواره لوله انتقال دهید و سپس کم کم کلونی را به محیط آبگوشت اضافه کنید تا به کدورت مورد نظر دست یابید .
• همیشه بعد از باز کردن در لوله و بعد از بستن ان ، سر لوله را در معرض شعله قرار دهید .
• اگر پنبه سر لوله ها ، به سطح هود افتاد باید آنها را دور انداخت .
• اگر سوآب را به خوبی آب گیری نکنیم در این صورت به علت تبخیر مایع بالایی در انکوباسیون ممکن است رطوبت در سر طرف مولر هینتون قرار گیرید .
• همیشه بعد از اینکه محیط کشت را با سواب کشت چمنی دادیم ، سواب را به ظرف حاوی مواد ضد عفونی یا استریل کننده انتقال دهیم .
• اگر نمونه مورد نظر ما مشکوک به سودوموناس است (بوی شبیه گل یاس) در این صورت سواب را ایتدا در روی ضعله قرار دهید و سپس به محیط ضد عفونی کننده انتقال دهید .
• هیچ وقت سواب را به دور محیط کشت حرکت ندهید .
• همیشه قبل از باز کردن محیط کشت ، سر پلیت را با ضعله ضد عفونی کنید .
• برای راحتی کار ، ایتدا دیسک ها را بر روی پلیت تعیین مکان کنید و سپس به محیط اضافه کنید .
• تا زمانی که دیسک ها را در روی محیط مولر هینتون ، فشار نداده اید می توانید جای انها را تغییر دهید . اما بعد از فشار هیچ وقت نباید آنها را تغییر داد .
• همیشه دیسک ها را از بالا توسط یک گیره به محیط اضافه کنید .
• فبل از گذاشتن دیسک سعی شود که هر دو طرف را برسی کنید تا اگر دیسک حاوی نام نباشد ، از به کار گیری ان خودداری کنید .

• اگر بیشتر از یک کلونی برداشت شود ، نتیجه تست ما کلا اشتباه خواهد بود . چون در این صورت با تست آنتی بیوگرام ، چند کلونی را از نظر حساسیت برسی کردیم که ممکن است یک کلنی حساس باشد و دیگری نه . پس دقت شود .
• اگر محیط کشت ما بعد از انکوبه ، به صورت خط خطی باشد نشان دهنده این است که مقدار کلونی ماکمتر از نیم مک فارلند بود .
• اگر در دور تمام دیسک ها هاله تشکیل شد و یا در اطراف هیچ یک از دیسک ها هاله ای تشکیل نشد برای برسی نتایج باید تست را تجدید کرد .
• اگر PH محیط مولر هینتون مناسب نباشد نتایج ما اشتباه خواهد بود .
• نگه داری غلط دیسک ها و استفاده از محیط های تاریخ گذشته موجب خطا می شود .
• تهیه اشتباه محیط نیم مک فارلند هم میتواند باعث اشتباه شود .
• تأخیر زیاد بین استاندارد کردن کدورت کشت و تلقیح پلیت
•   همراه بودن سواب با مقدار زیادی مایع آبگوشت به هنگام تلقیح محیط آنتی بیوگرام (نگرفتن مایع اضافی با جدار لوله)

• دیسک های مورد استفاده در آنتی بیوگرام

همان طور که در بالا هم گفتم ، باید از دیسک های مناسب باکتری ایزوله شده استفاده کرد . انتخاب نوع دیسک ها بسیار مهم است چون از یک طرف باید قضیه مقاوت داروئی را در نظر بگیریم و از طرف دیگر باید سلامت فرد را هم در نظر بگیریم برای نمونه :

بسیاری از باکتری ها کم کم به آنتی بیوتیک ها مخلفت مقاوم می شوند که این می تواند عمر آنتی بوتیک ها را کم کم به سوی افول هدایت کند .

و یا اینکه مصرف خود سر و یا اضافی که حاصل اشتباه فردی و یا اشتباه تکنیکی در تست انتی بیوگرام است می تواند عوارض گوناگونی داشته باشد . مثلا استفاده زیاد از سولفونامید ها باعث بیماری های عصب شنوایی و یا بیماری های کلیوی خواهد شد و یا اینکه مصرف زیاد پنی سیلین باعث تروبوسایتوپنی و مصرف زیاد تتراسایکلین باعث گرانولوسیتوپنی خواهد شد .

• نگهداری دیسک ها : دیسک ها باید در یخچال و یا در فریز نگه داری شوند . اگر دیسک ها به صورت STOCK هستند در دمای فریز باید نگه داری شوند اما دیسک ها به صورت روتین تا یک ماه در دمای یخچال نگه داری می شوند .
• کنترل کیفی :  به کمک سوشهای استاندارد و با مراجعه به جدول مربوطه می‌بایست نسبت به کنترل کیفی روند آنتی بیوگرام اقدام نمود.

چند نکته :

اگر باکتری ایزوله شده کوکسی گرم مثبت مانند استافیلوکوک طلائی (اورئوس) باشد در این صورت دو دیسک کلیندامایسن و اریترومایسن را در کنار هم و مقداری نزدیک تر قرار می دهیم . چون کلیندمایسن باعث می شود تا ژن القا کننده در اریترومایسن فعال شود . در واقع دیسک کلیندمایسن فعال کننده ژن خاموش اریترومایسن است .

• آمینوگلیکوزید ها بر روی باکتری های بی هوازی تاثیر می گذارند .
• کلروامفینیکل در نمونه ادراری استفاده نمی شود چون وارد ادرار نمی شود .
• ونکومایسن ، اریترومایسن ، کلیندمایسن ، پنی سیلین و چند تا دیگه بر روی باکتری های گرم مثبت تاثیر می ذارند .
•  دیسک ایمیپنم هم برروی گرم مثبت و هم بر روی گرم منفی تاثیر دارد ولی باید در عفونت های شدیدی استفاده شد تا مقاومت ایجاد نشود .
• سفالکسین که بر روی گرم مثبت و منفی تاثیر دارد به صورت خوراکی است .
• تتراسایکلین آنتی بوتیک وسیع الطیفی است و معمولا به صورت موضعی استفاده می شود .

در اخر هم باید ذکر کنم که دیسک ها را بر اساس نوع بیمارستان و یا نوع محل تست می توان تغییر داد و یا مکان و فاصله انها را هم تغییر داد و این که بسیاری از مراحل تست به صورت عالی انجام گیرند باید تجربه کافی داشت و همیشه سعی کنید که به بهترین نحو کار خود را انجام دهید .

جدول آنتی بیوتیک ها

برای شمارش انگل مالاریا مواردباید زیر را مد نظر داشت
1- شمارش انگل در گسترش ضخیم انجام می شود
2- شمارش انگل در مقابل گلبول های سفید انجام می شود
3- تعداد انگل را در میکرولیتر خون گزارش می کنیم.

توجه : در گسترش نازک  تعداد انگل را در مقابل گلبول قرمز شمارش می کنیم
در گسترش ضخیم اولین فیلد میکروسکوپ را می بینیم وتعداد گلبول سفید را شمارش می کنیم ، سپس تعداد انگل غیر گامتوسیت (چون در مقاومت دارویی بی اثر هستند) را در همان فیلد شمارش می کنیم وادامه می هیم تا وقتی که تعداد گلبول های سفید شمارش شده بیشتر از 200 باشد بطور استاندارد 200 گلبول سفید را باید بشماریم ( بشتر از 200 اشکال ندارد ولی نباید کمتر باشد(.
سازمان بهداشت جهانی می گوید در هر میکرولیتر خون 8000 گلبول سفید در نظر بگیرید ، بنابراین می توان با استفاده از یک تناسب تعداد انگل را در هر میکرو لیتر خون محاسبه کرد.   

     تعداد انگل در میکرولیتر خون   =   تعداد گلبول سفید شمارش شده  / 8000 * تعداد انگل شمارش شده

  
در گسترش نازک  می توانیم تعیین کنیم که چند درصد گلبول های قرمز آلوده هستند بدین صورت که تعداد انگل را در مقابل 1000تا 2000 گلبول قرمز شمارش می کنیم، (نباید کمتر از 1000 گلبول قرمز را شمارش کنیم) ودر نهایت درصد گلبول های قرمز آلوده از روش زیربدست می آید                                

درصد گلبول های قرمز آلوده= تعداد گلبول های قرمز شمارش شده /100* تعداد انگل شمارش شده 
در پلاسمودیوم  فالسی پاروم خیلی اهمیت دارد که درصد گلبول های قرمز آلوده را بدست بیاوریم زیرا بیشتر از 10 در صد آلودگی حالت خیلی خطر ناک در نظر گرفته می شود (نرمال آلودگی در فالسی پاروم 3 تا4 درصد ودر ویواکس 1 تا 2 درصد می باشد( .

یک روش دیگر جهت تعیین میزان انگل وجود دارد که در گسترش ضخیم انجام می شود ولی زیاد علمی نیست .
اگر در صد میدان 10-1 انگل وجود داشته باشد                               1+
اگر در صد میدان 100-11 انگل وجود داشته باشد                           2+ 
اگر در یک میدان 10-1 انگل وجود داشته باشد                                3+ 
اگر در یک میدان بیشتر از 100 انگل وجود داشته باشد                     4+ 
                                            

اهداف میکروب شناسی تشخیصی دارای دو بخش عمده است. بخش اول مربوط به تشخیص عامل ایجاد کننده بیماریهای عفونی بوده و از طریق مجزا نمودن و شناسائی عوامل عفونت و نشان دادن واکنشهای ایمنی بدن (تولید آنتی بادی – تغییر حساسیت جلدی) در بیماران صورت می‌گیرد. بخش دوم مربوط به کمک در امر انتخاب منطقی داروهای ضد میکروبی جهت درمان بیماران می‌باشد و بر اساس آزمایشات آزمایشگاهی انجام می‌گیرد.در زمینه بیماریهای عفونی نتایج آزمونهای آزمایشگاهی بنحو بارزی بستگی به خصوصیات و شرایط نمونه مورد آزمایش، زمان نمونه برداری و درجه کارآمد بودن و تجربه کارکنان آزمایشگاه دارد.هر پزشکی که با بیماری‌های عفونی سر و کار دارد باید بداند چه هنگام و چگونه باید از بیمار  نمونه برداری نموده، چه آزمایشاتی را درخواست کرده و نتایج حاصله را چگونه تفسیر نماید.

ارتباط بین پزشک و آزمایشگاه

از آنجائیکه هیچ روشی که به تنهایی بتواند تمامی میکروارگانیسم‌های پاتوژن را از غیر پاتوژن شناسائی کند وجود ندارد، به همین جهت قبل از اینکه کارکنان آزمایشگاه بتوانند تکنیک‌های لازم را جهت مجزا نمودن میکروارگانیسم خاص به کار گیرند، پزشک باید اطلاعاتی در مورد تشخیص احتمالی، نوع عامل یا عوامل پاتوژن مشکوک را به آزمایشگاه بدهد.روشهای آزمایشگاهی میکروبشناسی کند بوده و محتاج به طی نمودن مراحل پی در پی قبل از نیل به نتیجه می‌باشد.با این وصف جایز نیست که درمان بیماران تا آماده شدن نتیجه به تعویق افتد. با در نظر گرفتن شرایط فوق، بسیار اهمیت دارد که پزشک معالج نمونه‌های لازم را تهیه نموده و همراه با آن اطلاعات مربوط به تشخیص احتمالی را به آزمایشگاه ارسال نموده و سپس درمان مناسبی که به نظر می‌رسد بر روی عامل بیماری مؤثر باشد را آغاز نماید.

خصوصیات نمونه‌های مورد آزمایش

نتیجه بسیاری از تستهای تشخیصی در بیماری‌های عفونی به نمونه مورد آزمایش، زمان انتخاب شده جهت نمونه برداری و روش نمونه برداری بستگی دارد.محافظت از نمونه  و ارسال آن باید به نحوی باشد که در طی این عملیات عامل بیماری از بین نرود. جدا نمودن یک عامل عفونی از نقاط استریل بدن از ارزش تشخیصی زیادی برخوردار می‌باشد. هر نوع میکروارگانیسمی که از خون، مایع نخاع، مایع مفصلی یا مایعی که از حفره جنب بدست آمده، مجزا گردد، یک یافته پرارزش تشخیصی قلمداد می‌شود.اصول کلی که در مورد تمام نمونه‌های بالینی صادق بوده و باید در هنگام اخذ نمونه به آنها توجه نمود به قرار زیر است:

1. نمونه از لحاظ مقدار بایستی کافی بوده تا بتوان کلیه آزمایشات لازم را بر روی آنها انجام داد.
2. نمونه بایستی از خصوصیت «معروف بودن» (Representative) برخوردار باشد (مثلاً اگر خلط بخواهد مورد آزمایش قرار گیرد، آب دهان به جای آن گرفته نشود).
3. باید توجه نمود که نمونه به نحوی گرفته شود که آلوده نگردد و جهت نمونه برداری بایستی از وسایل استریل استفاده نموده و شرایط آسپتیک رعایت شود.
4. نمونه تهیه شده بایستی سریعاً به آزمایشگاه ارسال شود.
5. نمونه‌های ارزشمندی بایستی قبل از آغاز درمان ضد میکروبی گرفته شوند و اگر بیمار قبلاً تحت درمان بوده باید در صورت امکان درمان را متوقف نموده و نمونه برداری چند روز پس از توقف درمان صورت گیرد.
   

جمع آوری نمونه

جمع آوری مناسب یک نمونه جهت کشت بی‌شک مهمترین مرحله در اثبات وجود یک پروسة عفونی توسط یک میکروارگانیسم خاص می‌باشد. چنانچه درمان بر ضد ارگانیسم کومنسال یا آلوده کننده باشد، جمع آوری نامناسب نمونه نه تنها باعث عدم جداسازی میکروارگانیسم مربوطه می‌شود بلکه منجر به درمان نادرست و حتی مضر می‌شود.

در جمع آوری نمونه‌ها بایستی موارد زیر را در نظر داشت:

1. نمونه باید ناحیه اصلی عفونت جمع آوری شده و حداقل آلودگی با ترشحات یا ارگانها یا بافتهای مجاور داشته باشد.
2. زمان مناسب جهت جمع آوری نمونه بایستی مشخص گردد تا بدین ترتیب شانس جداسازی میکروارگانیسم‌ها به حداکثر رسد. مثلاً در تب تیفوئیدی میکروارگانیسم عامل عفونت را می‌توان در طی هفته اول بیماری از خون جدا نمود. کشت مدفوع و یا ادرار معمولاً در طی هفته دوم و سوم بیماری مثبت خواهد شد. آگلوتینین‌های سرمی در طی هفتة دوم شروع به افزایش کرده و در طی هفته پنجم به ماکزیمم مقدار خود می‌رسد.
3. مقدار کافی از نمونه مورد نظر به منظور انجام تکنیک‌های کشت باید گرفته شود و دستورالعمل‌های لازم درمورد حجم مناسب نمونه مورد نظر جهت کشت باید تنظیم گردد. نمونه‌های ناکافی بایستی نگهداری شوند. چنانچه تهیه نمونه‌ای مجدد میسر نبود، و از نظر کلینیکی نیز کشت نمونه اندیکاسیون داشت بایستی روی نمونة اولیة ناکافی کارهای لازم انجام گیرد، با این وجود آزمایشگاه هنگام گزارش نتیجه باید شرایط نمونه دریافتی را برای پزشک گزارش نماید.
4. به منظور اطمینان از جداسازی مطلوب میکروارگانیسم باید از لوازم نمونه گیری، ظروف و محیط‌های کشت مناسب استفاده نمود. ظروف نمونه گیری بایستی دارای درپوش محکم و مناسبی باشد که از نشت و آلودگی نمونه هنگام انتقال جلوگیری شود. سواب‌های پنبه ای ممکن است حاوی بقایای اسیدهای چرب باشد و سواب آلژینات کلسیم نیز ممکن است باعث نشر محصولات سمی شده و در نتیجه موجب ممانعت از رشد برخی از باکتریهای مشکل پسند گردد، لذا استفاده از سواب هائی از جنس داکرون یا پلی استر توصیه می‌شود. سواب‌های حاوی نمونه را باید در یک محیط انتقال دهنده یا ظرف مرطوب جهت جلوگیری از خشک شدن و مرگ باکتری قرار داد.
5. حتی الامکان بایستی جمع آوری نمونه جهت کشت قبل از تجویز آنتی بیوتیک صورت گیرد.

 

انتقال نمونه

محیط‌های انتقال دهنده کری – بلیر، Amies و استوارت.

دریافت نمونه و مشاهدات اولیه

در اکثر آزمایشگاههای تشخیص طبی محل مخصوصی جهت دریافت نمونه‌های کشت طراحی شده است. به علت احتمال آلودگی پرسنل آزمایشگاه با باکتریها و ویروسهای پاتوژن انتقال و مشاهدات اولیه بایستی زیر هود انجام گردد. ضروریست پرسنل با پوشیدن روپوش مخصوص و دستکش و در برخی موارد ماسک‌های جراحی از خود در برابر این عوامل بیماریزا محافظت نمایند.

آماده سازی نمونه شامل موارد زیر می‌باشد.

• ثبت اطلاعات ضروری در دفتر آزمایشگاه یا شبکه کامپیوتری
• مشاهده و بررسی نمونه از لحاظ ویژگیهای لازم جهت پذیرش.
• در مورد برخی نمونه‌ها مشاهده میکروسکپی نمونه به صورت مستقیم یا گسترش رنگ‌آمیزی شده از آن به منظور تشخیص احتمالی.

اریتراسما  Erythrasma

تعریف:

عفونت مزمن طبقه شاخی پوست بوده و معمولا چین های بدن از جمله بین انگشتان پا ، کشاله ران و نواحی پری آنال ، زیر پستان ها و زیر بغل را گرفتار می سازد . ضایعات بیماری بصورت لکه ها یا ماکول های قرمز ، قهوه ای و یا قرمز مسی خشک و بدون ترشح و التهاب و بدون پوسته ریزی می باشند ممکن است پوسته ها یا شوره های ریزی در سطح ضایعات دیده شود .

سیاه زخم چیست؟

عامل آن باسیل بزرگ گرم مثبت با توانایی تولید اسپور میباشد. که اسپور نسبت به شرایط سخت محیطی بسیار مقاوم بوده و مدت طولانی در هوا و بویژه خاک زنده میماند. باسیل آنتراکس در حیوانات بیشتر دیده می شود لذا افرادیکه در تماس بیشتر با حیوانات و فرآورده های حیوانی آلوده قرار دارند، بیشتر گرفتار میشوند.

مقدمه :

 از بین وسایل مورد استفاده در بخش میکروب شناسی لوپ میکروب شناسی از جمله ابزارهای مهم و اصلی بوده و ارزش آن همانند پی پت در آزمایشگاه بیوشیمی و سرولوژی است .بدین معنی که اگر از مقدار برداشت شده توسط لوپ محاسبه دقیق به عمل نیاید در گزارش نتایج آزمایش تاثیر زیادی خواهد داشت . لذا به سبب عدم وجود روش استاندارد جهت کالیبراسیون لوپ و نظر به اهمیت آن در این مقاله سعی شده است که راه کارهای مناسب و عملی برای کالیبراسیون لوپ میکروب شناسی ارائه گردد . در بررسی انجام شده دو روش محاسبه حجم توسط روش اسپکتروفتومتری و روش استفاده از ترازو مورد ارزیابی قرار گرفته اند .  

روش بررسی : در این تحقیق حجم برداشت شده توسط دو نوع لوپ مورد مصرف که تحت عنوان لوپ های تجاری در بازار موجود بوده و به عنوان لوپ ۰.۰۱ و لوپ ۰.۰۰۱ استفاده میشوند مورد بررسی قرار گرفت و نیز با توجه به اینکه برخی از آزمایشگاه های تشخیص پزشکی لوپ های دست ساز را که با استفاده از پیچیدن سیم به دور دسته فلزی لوپ تهیه می شوند مورد استفاده قرار می دهند این نوع لوپ ها نیز به دو روش اسپکتروفتومتری و توزین مورد ارزیابی قرار گرفتند . همچنین مقدار حجم برداشتی توسط لوپ ها به صورت تخمینی و از طریق ریاضی مورد بررسی قرار گرفت .

الف ) روش اسپکتروفتومتری : در این روش از یک ماده رنگی که دارای جذب نوری در طول موج خاص است استفاده می گردد . معمولا از ماده رنگی اوانس بلو برای این آزمایش استفاده میشود اما با توجه به کمبود و گران بودن ماده مزبور در این بررسی از متیلن بلو که از نظر اقتصادی به صرفه بوده و در اکثر آزمایشگاه ها موجود است استفاده شد .

مواد مصرفی و معرف ها شامل موارد زیر بود :

پودر متیلن بلو – الکل طبی ۹۶% ( اتانول ) – آب مقطر – لوپ های ۰.۰۱ و ۰.۰۰۱ و لوپ های دست ساز – لوله آزمایش – پی پت – سمپلر ۲۰ لاندا – اسپکتروفتومتر

ابتدا ۰.۲ – ۰.۱ گرم از پودر متیلن بلو را در حلالی که از مخلوط کردن آب مقطر و الکل ۹۶% به نسبت ۵۰ به ۵۰ تهیه شده حل می کنیم . پس از حل شدن کامل متیلن بلو در حلال مزبور ۸ لوله آزمایش انتخاب کرده در لوله اول ۲ میلی لیتر و در بقیه لوله ها ۱ میلی لیتر از حلال ساخته شده را می ریزیم . سپس مقدار ۰.۰۲ میلی لیتر از محلول متیلن بلو را به کمک سمپلر کالیبره شده به محلول اضافه کرده و پس از مخلوط کردن ۱ میلی لیتر از محلول مزبور را به لوله دوم انتقال می دهیم و این عمل را تا لوله هشتم پی می گیریم ( رقت های سریالی ).پس از تهیه رقت های مزبور جذب نوری هر یک از لوله ها را در طول موج ۶۶۳ نانومتر قرائت کرده و ثبت می کنیم .

با توجه به کاهش تصاعدی رقت لوله ها از کاغذ لگاریتمی برای تهیه منحنی استاندارد استفاده میشود . پس از ترسیم منحنی برای کالیبره کردن لوپ ۱۵-۱۰ لوله برداشته و در هر یک از آنها ۱ میلی لیتر از حلالی که تهیه کرده بودیم می ریزیم و به کمک لوپ از محلول رنگی ( متیلن بلو ) در لوله ها وارد می کنیم . پس از خواندن جذب نوری آنها در طول موج ۶۶۳ نانومتر و به دست آوردن میانگین جذب نوری و انتقال آن بر روی منحنی مقدار حجم برداشته شده توسط لوپ به راحتی به دست می آید .

از آنجا که مقدار کلنی بر اساس CFU/ml ( colong forming unit ) گزارش می گردد اگر ۱ میلی لیتر را که برابر با ۱۰۰۰ لاندا می باشد بر حجم به دست آمده تقسیم کنیم ضریب لوپ مجهول به دست خواهد آمد.

ب ) روش توزین : در این روش ترازوی حساس با دقت ۰.۰۰۱ گرم مورد نیاز است و از آنجا که وزن و حجم آب مقطر خالص مساوی هستند می توان به کمک لوپ از آب مقطر برداشت کرد و بر روی یک دیسک آنتی بیوگرام قرار داد و با توزین توسط ترازو مقدار حجم برداشتی را محاسبه کرد . در این روش ابتدا دیسک آنتی بیوگرام توزین می شود سپس مقدار افزایش وزن بر اثر برداشت آب مقطر توسط لوپ محاسبه می گردد . اگر این عمل را ۱۵- ۱۰ بار تکرار کرده و میانگین افزایش وزن را ثبت کنیم حجم برداشتی توسط لوپ به دست خواهد آمد.

ج ) روش محاسبه ریاضی : در این روش اگر قطر سیم مورد استفاده در ساخت لوپ را توسط میکرومتر اندازه گیری کرده و قطر داخلی حلقه لوله را توسط کولیس محاسبه کنیم حجم برداشتی از طریق محاسبه حجم استوانه به دست می آید . این روش برای محاسبه مقدار برداشتی توسط لوپ چندان دقیق نیست زیرا حجم برداشتی توسط لوپ در مقایسه با روش های استاندارد حجم بیشتری را نشان می دهد و در عمل از آنجا که کشش سطحی بافت باعث می شود مقدار کمتری از محلول در مرکز لوپ قرار گیرد میزان برداشتی نهایی کمتر خواهد بود .

نتیجه بررسی : مقایسه نتایج حاصل از بررسی ۳ روش فوق نشان می دهد که حجم برداشت شده توسط لوپ هایی که به عنوان لوپ تجاری عرضه میشوند استاندارد نیست برای مثال با لوپ تجاری ۰.۰۰۱ مقدار برداشتی لوپ ۰.۶ لاندا می باشد و در مورد لوپ ۰.۰۱ مقدار برداشتی ۲.۴ لاندا است . در نهایت ضریب لوپ ۰.۰۰۱ برابر با ۱۶۶۶.۶۶ و لوپ ۰.۰۱ برابر با ۴۱۶.۶۶ و لوپ دست ساز تقریبا معادل ۳۳۸ است که با مقادیر ادعا شده تفاوت دارند.

نتیجه گیری : با توجه به بررسی های مزبور موارد زیر پیشنهاد میشود :

۱- لوپ هایی که تحت عنوان ۰.۰۱ و ۰.۰۰۱ به صورت تجاری به فروش می رسند استاندارد نبوده و هر آزمایشگاه می باید نسبت به کالیبراسیون و تععین ضریب دقیق لوپ مصرفی اقدام کند.

۲- در صورت عدم کالیبراسیون لوپ مصرفی شمارش کلنی در کشت ادرار به صورت تخمینی گزارش شود. ( کمتر از ۱۰۰۰ یا ۱۰۰۰۰-۱۰۰۰ یا بیشتر از ۱۰۰۰۰ )

۳- برای کالیبراسیون لوپ به علت مجهز نبودن اکثر آزمایشگاه ها به ترازوی حساس روش اسپکتروفتومتری پیشنهاد می شود .

۴- حتی المقدور سعی گردد تا لوپ ها به صورت پلاستیکی و یک بار مصرف تهیه شود .

آزمایش پیشگیرانه سل ارائه می شود  .

پژوهشگران می گویند یک گام به سوی ارائه آزمایش خون پیشگیرانه سل نزدیک تر شده اند. 
   
 
به گزارش خبرنگار سایت پزشکان بدون مرز به نقل از ایندیپندنت ، بررسی اثر دی ان آ در خون می تواند تشخیص دهد کدام یک از ناقلان سل ، نشانه های این بیماری را بروز داده و عفونت را گسترش می دهند.
این آزمایش می تواند به تشخیص زودهنگام سل و ارائه درمانی برای این بیماری ریوی منجر شده و جان انسانهای بسیاری را از مرگ نجات دهد.
آزمایش های کنونی و رایج خون و پوست فقط می تواند نشان دهد که آیا فردی حامل سل است یا خیر، اما علایم آن را نشان نمی دهد. از سوی دیگر با شیوه های رایج پیش بینی اینکه چه کسی به نوع پیشرفته بیماری مبتلا می شود غیر ممکن است.
محققان انگلیس، آمریکا و آفریقای جنوبی نشانگرهای ژنتیکی را در خون ۱۰ درصد فرد مبتلا به سل فعال شناسایی کردند.
دکتر آن او گارا سرپرست این تحقیقات گفت: پیش بینی اینکه کدام ناقل سل به بیماری پیشرفته مبتلا خواهد شد، می تواند نتایج مهم و چشمگیری در پیشگیری از همه گیری این بیماری داشته باشد.
این محققان می گویند شیوه جدید تشخیصی بر اساس آزمایش خون؛ می تواند به ویژه در مبتلایان به ایدز و سل مهم باشد، چرا که شیوه معمول تشخیص بیماری با آزمایش خلط اغلب کارایی ندارد.
اوگارا افزود: این آزمایش خون اگرچه بسیار امیدوار کننده است، اما به تحقیقات بیشتری نیاز دارد.

ژلوز صفرا-اسکولین برای باکتروئیدز Bacteriodes Bile Esculin(BBE) Agar

باکتروئیدز صفرا-اسکولین آگار یک محیط ژلوزدار انتخابی افتراقی است که برای بدست آوردن باکتری های گروه باکتروئیدز فرازیلیس مورد استفاده قرار می گیرد.این محیط حاوی صفرا،اسکولین،سیترات آمونیوم فریک،همین،ویتامین K₁   و برخی اوقات جنتامایسین، همراه با یک پایه آگار حاوی دانه سویا می باشد.رشد ارگانیسم های غیر از گروه باکتروئیدز فراژیلیس بوسیله صفرا و جنتامایسین مهار می گردد.افزودن همین و ویتامین K₁  به آگار سبب کامل شدن آن می گردد،رشد گونه های باکتروئیدز راتحریک می کند.هیدرولیز اسکولین با تبدیل اسکولین به اسکولیتین و بر اثر واکنش با سیترات آمونیوم فریک و ایجاد کلنی های سیاه رنگ تشخیص داده می شود.

انواع تست های تشخیصی میکروب شناسی:

1-تست کاتالاز :

به منظور جداسازی باکتری های تجزیه کننده H₂O₂ .

محلول 3% H₂O₂ +یک لوپ از باکتری روی لام :

-خروج گاز←  کاتالاز +

-عدم خروج گاز ← کاتالاز –

2-تست اکسیداز :

به منظور جداسازی باکتری های اکسید کننده .

روی دیسک مخصوص با لوپ چوبی کلنی های کمی از باکتری می گذاریم :

-ارغوانی ←  اکسیداز +

-بدون تغییر رنگ ←  اکسیداز –

3- تست کوآگولاز :

به منظور جداسازی باکتری های Coagulator یا لخته کننده سرم خون.

رقیق کردن سرم انسانی 4 الی 5 بار+ انکوباسیون 37 درجه + باکتری :

- ایجاد لخته ← کوآگولاز +

- بدون لخته ← کوآگولاز –

4- تست اوره آز:

به منظور جداسازی باکتری های حاوی آنزیم اوره آز.

تست اوره آز :

Rapid-: بیوپسی از معده برای تشخیص H.pylori

-معمولی و متعارف :در محیط کشت(پلیت ) انجام میگیرد.

اوره آگار + باکتری :

-تولید CO₂  و آمونیاک← تغییر رنگ اندیکاتور← اوره آز+

-بدون تغییر رنگ ← اوره آز –

5-تست سیترات :

به منظور جداسازی باکتری های استفاده کننده از چرخه گلی اکسیدات و سیترات به عنوان منبع کربن.

محیط کشت سیمون سیترات (سبز رنگ) + باکتری:

-رنگ آبی ← سیترات  +

-رنگ سبز ←سیترات –

6-تست حلالیت در صفرا :

به منظور جداسازی باکتری هایی که در صفرا حل می شوند .

باکتری + محیط کشت نوترینت براث (زرد)PH=7/2 ،15 تا 30 دقیقه انکوبه شود +یک قطره فنل رد +چند قطره  SDS 10% :

-شفاف شد ←+

-شفاف نشد ← -

7-تست MR ، VP :

به منظور جداسازی انتروباکتریاسه ها.

محیط کشت MR,VP + باکتری در لوله آزمایش +معرف MR +انکوباسیون 37 درجه 24 ساعت :

-هاله قرمز ← MR+

-بدون هاله  ← MR –

8-تست OF :

به منظور تشخیص باکتری های تخمیر کننده قند مانیتول.

نوترینت براث + 5/0 درصد قند مانیتول +معرف یا اندیکاتور :

-PH اسیدی:تخمیر قند و تغییر رنگ  ← OF+

- بدون تغییر رنگ  ←OF –

١- پپتون واتر :

افتراقی است.برای جداسازی باکتری های تخمیر کننده ی قند و نمونه های مشکوک به وبا (مدفوعی)استفاده می شود.

2- پپتون واتر قلیایی :

افتراقی است.برای جداسازی vibrio cholera  ( عامل وبا ، قلیا دوست) استفاده می شود.

3- نوترینت آگار :

معمولی است.برای رشد اکثر باکتری هاست.آگار دارد و جامد است.

4- نوترینت براث :

معمولی است. برای رشد اکثر باکتریهلست.فاقد آگار بوده و مایع است.

5 - blood agar :

غنی شده است. باکتری هایی که توانایی لیز کردن  خون را دارن رشد می یابند.(نوترینت آگار + خون)

در واقع با بلاد آگار الگوی هولیز را می توانیم تشخیص دهیم

انواع باکتریها از نظر لیز خون:

a-بتا هولیتیک : لیز کننده ی کامل خون  ←هاله سفید رنگ در plate

b-آلفا هولیتیک : لیز کننده ی ناقص خون   ←هاله سبز رنگ در plate

 non-hemolytic-c : لیز نکننده ی خون ←بدون هاله

6- chocolate agar :

غنی شده است.تحت دمای زیاد (60-70 درجه) به آن خون اضافه می شود.به همین دلیل رنگ قهوه ای شکلاتی می گیرد.

باکتری هایی که نیاز به مواد اختصاصی حاصل از همولیز دارند (مانند نایسریاها و هموفیلوس های پاتوژن ) در شکلات آگار رشد می کنند.

7- modified chocolate agar :

غنی شده است.اگر شکلات آگار را به جای اینکه از پایه ی بلاد آگار بسازیم از تریپتیکاز سوی آگار (TSA)(و یا از مولر هینتون آگار)  بسازیم، شکلات آگار تغییر یافته ساخته ایم.

8- Mac Conkey :

افتراقی و انتخابی است.برای جداسازی خانواده انتروباکتریاسه و لاکتوز مثبت ها و منفی ها استفاده می شود.(رنگشان متفاوت است)

9- ائوزین متیلن بلو (EMB) :

افتراقی و انتخابی است.برای جداسازی باکتری های گرم منفی به کار می رود.مثلا اکلای در این محیط رنگ و جلای فلزی میگیرد.

10-Thayer-Martin :

انتخابی است.برای جداسازی باکتری های گرم منفی است.حاوی آنتی بیوتیک است.

بقیش اینجاست

محیط های کشت را از نظر قوام به سه گروه تقسیم می کنیم:

اولین گروه مایع هستند که براث نامیده می شوند مانند نوترین براث- مولر هینتون براث 

در این نوع محیط های کشت که به صورت سوسپانسیون هستند حرکت دیده نمی شود.

دومین گروه جامد هستند که آگار نامیده می شوند مانند نوترین آگار- مولر هینتون آگار

سومین گروه محیط کشت های نیمه جامد هستند که مقدار آگار آن ها نسبت به محیط جامد کمتر استیک تا پنج درصد آ)گار دارند).

این نوع محیط های کشت زمانی استفاده می شوند که بخواهیم حرکت باکتری ها را مشاهده کنیم.

محیط های کشت باکتری را از نظر نوع مواد تشکیل دهنده و از نظر کاربرد به چهار دسته تقسیم می کنند:

محیط کشت پایه (Basic Media) :
این محیط کمترین مقدار مواد غذایی برای رشد باکتریها را دارد . و مبنای تهیه انواع و اقسام محیطهای کشت می باشد . اکثر انواع باکتریها در آن رشد می کنند زیرا فاقد ماده ضد میکرب است . مانند محیط نوترینت آگار ، نوترینت براث .

محیط کشت غنی کننده (Enrichment Media) :
محیط مقوی بوده که دارای مواد تغذیه ای زیادی نظیر ویتامین ها ، لیپید ها ، اسید های آمینه برای رشد باکتری است . بنابراین تعداد زیادی از باکتریها روی آن بخوبی رشد می کنند . مانند شکلات آگار، بلادآگار .

محیط کشت افتراقی (Differential Media) :
محیط کشت تشخیصی بوده که کلنی باکتریهای مختلف روی آن کاملا از همدیگر متمایز می گردد. مانند محیط E.M.B ، M.c این محیطها دارای املاح صفراوی ، قند و معرف شیمیایی هستند که باکتریهای لاکتوز مثبت برروی آنها کلنی های صورتی رنگ و باکتریهای لاکتوز منفی نظیر سالمونلا ، شیگلا بر روی این محیط ها کلنی های سفید رنگ تشکیل می دهند . از محیطهای افتراقی دیگر محیط TSI ، سیمون سیترات را میتوان نام برد . این محیط ها برای رشد باکتریهای گرم - منفی روده ای (انتروباکتریاسه) مناسب هستند . چون وجود املاح صفراوی در محیط مانع از رشد باکتریهای گرم مثبت در محیط می شوند.

محیط کشت اختصاصی (Special Media) :
این محیطها برای رشد باکتریهای خاصی مناسبند . از این محیطها برای ایزوله نوع خاصی از باکتری در یک مخلوط میکربی استفاده می شود . مانند محیط s.s آگار که برای جدا کردن سالمونلا و شیگلا بکار میرود یا مانیتول سالت آگار که برای تشخیص گونه بیماریزای استافیلوکوکوس اورئوس استفاده می شود .

محیط کشت انتخابی : (Selective Media )
محیط هایی وجود دارند که دارای یک ماده مهار کننده رشد می باشند این مواد رشد تمام ارگانیسم ها بجز ارگانیسم مورد نظر را مهارمی کنند . درمرحله اول از رنگ هایی که دارای خواص ضد میکروبی هستند استفاده می شود ودر مرحله بعد استفاده از آنتی بیوتیک ها و مرحله آخر شامل وارد کردن مواد ترکیبی به محیط کشت جهت فعالیتهای متابولیکی ارگانیسم مورد نظر می باشد . از آنجا ئیکه این محیط ها جهت ارگانیسم مورد نظر انتخاب شده اند و برای سایر ارگانیسم ها مضر می باشند آنها را محیط های انتخابی می نامند . مثالی از این نوع محیط ها ، محیط کشت فنیل اتیل الکل آگار است که از رشد باسیل های گرم منفی هوازی و بی هوازی اختیاری ممانعت بعمل آورده و به ارگانیسم های گرم مثبت اجازه رشد می دهد . 

متیلن بلو (به انگلیسی: Methylene blue)

رده درمانی: آنتی‌دوت‌ها،شلات‌کننده‌ها و آنتاگونیست‌ها

اشکال دارویی: آمپول ، قرص

موارد مصرف

متیلن بلو قبلا در درمان موارد متهموگلوبینمی (مانند مسمومیت با سیانید) استفاده می‌شد ، اخیرا در درمان آلزایمر نیز مطرح شده‌است. همچنین فرم خوراکی آن در دندانپزشکی برای تشخیص مناطق دارای پلاک میکروبی دندان و نیز در تشخیص فیستول در جراحی استفاده می‌شود.

مکانیسم اثر

متیلن بلو احیاءشده متهموگلوبین را مجدداً احیاء می‌کند وخود به متیلن بلو تبدیل شده و سپس از طریق ادرار دفع می‌گردد.

عوارض جانبی

تهوع ، اسهال ، سردرد ، سرگیجه ، نغییر رنگ ادرار ، همولیز ، هایپرتانسیون.

کاربرد در صنعت

متیلن بلو یک ماده رنگزای فونکسیونل که به عنوان یک رد-اُکس-ایندیکاتورعمل کرده و درحالت‌های اکسید یا احیاء شده دارای رنگهای مختلف (آبی /بی رنگ) می‌باشد.یکی از آزمایش‌های تعیین کیفیت شیر که با آن تعداد باکتری‌های موجود در شیر خام تخمین زده می‌شود ، آزمایش احیای متیلن بلو است .

محیط کشت ائوزین متیلن بلو در کشت میکروب‌ها به کار می‌رود.متیلن بلو برای رنگ آمیزی بافتها نیز استفاده می‌شود.

بعضی از باکتریها ماده لزجی از خود ترشح می کنند که خارج از سلول و پیرامون آن جمع می شود و دیواره سلولی را می پوشاند . این لایه کپسول نامیده می شود که ضخامتهای متفاوت و چسبندگی متغیر دارد. اندازه کپسول به محیط کشت میکروبی بستگی دارد و همچنین باکتریهای بیماریزا ، در بین باکتریهای تولید کننده کپسول ، کپسولهای بزرگتری دارند. جنس این کپسول از پلی ساکارید است که در آب محلول و غیر یونی است .

کاربرد کپسول در باکتریها :

کپسول بعنوان یک سد اسمزی بین باکتری و محیط اطراف آن عمل می کند و در واقع  نقش حفاظتی دارد. کپسول مانع از عمل بیگانه خواری گلبولهای سفید می شود همچنین بعنوان مخزن ذخیره مواد غذایی یا دفع مواد زائد هم می تواند عمل کند.

در تعدادی از باکتریهای بیماریزا ، وجود کپسول شدت بیماریزایی و عفونت زایی را افزایش می دهد و ممکن است حتی این بیماریزایی به وجود کپسول بستگی داشته باشد . مثلا در استرپتوکوکوس پنومونیا اگر توانایی تولید کپسول در باکتری از بین برود این باکتری غیر بیماریزا می شود.

در عمل رنگ آمیزی شرط رنگ گیری یک سلول یونی بودن آن می باشد یعنی وقتی سلول حالت یونی داشته باشد هنگام رنگ آمیزی بین نواحی یونیزه سطح سلول و اجزای یونیزه مولکولهای رنگ پیوند بوجود می آید . در نتیجه بین بارهای مخالف موجود در سطح سلول و مولکولهای رنگ پیوند یونی تشکیل می شود و باکتری رنگ می گیرد . اما چون کپسول را بعلت غیر یونی بودن آن نمی توان رنگ آمیزی کرد در نتیجه برای دیدن آن در زیر میکروسکوپ ، زمینه باکتری رنگ آمیزی می شود و در نتیجه امکان دیدن کپسول باکتری که بصورت بیرنگ ظاهر می شود ، فراهم می شود. این روش را رنگ آمیزی منفی می نامند.

در این روش رنگ آمیزی برای تثبیت گسترش از حرارت استفاده نمی شود . چون در اثر حرارت ، باکتری در داخل کپسول از شکل طبیعی خود خارج می شود.

روش کار در رنگ آمیزی کپسول :

1- روی یک لام تمیز بمقدار مساوی از مرکب چینی و سرم فیزیولوژی را با هم مخلوط کرده و با لوپ (نوک آنس) مقدار کمی از کشت باکتری را به آن اضافه کنید ، سوسپانسیون را به آرامی و کاملا مخلوط کنید و گسترش را پخش کنید و بگذارید در مجاورت هوا خشک شود.

٢-       سطح گسترش را با آبی متیلن لوفلر بپوشانید و بگذارید 3 دقیقه بماند . بعد رنگ اضافی را خالی کرده و بعد با آب مقطر آنرا شستشو دهید. در این هنگام ممکن است مقداری از گسترش نیز شسته شود و این جای نگرانی ندارد چون گسترش ضخیم است و حتما مقداری از آن برای مطالعه شما باقی می ماند.

٣-        لام را با زاویه 45 درجه نگدارید و بگذارید در مجاورت هوا خشک شود . توجه داشته باشید که هیچگاه کاغذ خشک کن را روی آن نکشید.

اگر محیط مایع بود استفاده از سرم فیزیولوژی ضروری نیست .

هنگام مخلوط کردن کشت با مایع به آرامی هم بزنید تا آرایش باکتریها بهم نخورد.

طرز تهیه رنگها و محلولها :

1-        آبی متیلن لوفلر

- آبی متیلن                           3/.گرم

- اتانول95%                        30سی سی

- آب مقطر                           100سی سی

رنگ را در اتانول حل کنید . آب مقطر را به آن اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را با استفاده از قیف از کاغذ صافی عبور دهید.

2-        سرم فیزیولوژی

- کلرور سدیم                       85/.گرم

- آب مقطر                         100سی سی

کلرور سدیم را در آب مقطر حل کنید.

آگار عصارهٔ خشک جلبک‌های قرمز از نوع GELIDIUM است که از نظر شیمیایی استر سولفوریک گالاکتان می‌باشد. بشکل قطعات باریک نازک شفاف ، یا گرد سفید خاکستری رنگ بی مزه و بی بو است . در آب سرد نامحلول است ولی ابتدا در آبجوش آن را حل کرده و سپس در ۳۵ تا ۴۰ درجهٔ سانتی گراد یا کمتر سرد نموده بصورت ژل در می‌آورند.

کاربرد درمانی

به عنوان یک ملیّن مخصوصاً در یبوست‌های مزمن، بکار می‌رود و بدون جذب شدن از روده می‌گذرد. همچنین ضد زخم معده و دوازدهه است. بصورت کپسول یا محلول معلّق در آب و یا ژله به مقدار ۴ تا ۱۶ گرم از راه دهان بکار می‌رود. آگار عمدتاً برای تهیهٔ محیط کشت در میکروب‌شناسی آزمایشگاهی مصرف می‌شود.

هشدار:ژلوز یک مادهٔ سمی نیست و به مقدار کم در قنادی‌ها،خوراک پزی‌ها مصرف می‌شود اما استعمال آن به مقدار زیاد و یا مکرر در اشخاص مسن اولاً باعث بالا رفتن کلسترول خون شده و ثانیاً انسداد حقیقی روده خواهد شد.

آندوسپورهای (هاگهای) باکتریایی ، ساختارهای کروی و یا بیضی شکل کوچکی هستند که نسبت به دمای بالا ، تشعشع و وجود مواد شیمیایی از قبیل ضد عفونی کننده ها بسیار مقاوم هستند . هاگها به شکل درون سلولی توسط برخی از باسیلها تولید می شوند به همین دلیل به آنها آندوسپور می گویند. آندوسپورها از سلولهای مولد کوچکترند و مشخصات متقاوتی دارند که قابل توجه تر از همه مقاومت زیاد آنها نسبت به شرایط نامساعد است .

هاگ بخشی ازچرخه زندگی بعضی از جنسها باکتریها می باشد و در واقع هاگ یک مرحله خفته یا غیر فعال از زندگی باکتری است . هاگزایی در باکتریها بر خلاف آنچه در بعضی گیاهان عالی دیده می شود ، نوعی تکثیر تولید مثلی نیست. زیرا هر باکتری فقط یک هاگ تولید می کند و هر هاگ به نوبه خود به یک سلول رویشی (باکتری فعال) تبدیل می شود. بنابراین در گونه های مولد هاگ مانند سایر گونه های باکتریایی تکثیر از طریق تقسیم دوتایی باکتری انجام می شود.

وجود هاگ در کشت باکتریها برای تشخیص و تفکیک آنها اهمیت دارد ، زیرا تشکیل هاگ اساسا محدود با باکتریهای گرم مثبت میله ای شکل در دو جنس باسیلوسها و کلستریدیومها است .

اندازه و محل قرار گرفتن هاگ در داخل باکتری نیز برای تشخیص ارگانیسمها اهمیت دارد مثلا هاگها می توانند در مرکز ، نزدیک به انتها و یا در انتهای یاخته قرار بگیرد. قطر هاگ می تواند بزرگتر و یا کوچکتر از خود باکتری باشد . اگرهاگ قطر بیشتری نسبت به یاخته رویشی داشته باشد موجب تورم یا بزرگی و تغییر شکل باکتری می شود.

اسید فاست بمعنای مقاومت در مقابل رنگ بری با یک رنگ بر اسیدی می باشد. این خاصیت در باکتریها بسیار نادر است و فقط باکتریهای جنس مایکوباکتریوم و بعضی گونه های جنس نوکاردیا ، اسید فاست هستند. استافیلوکوکوس اپیدرمیس را هم می توان جزء باکتریهای اسید فاست دانست.

بطور کلی در دیواره سلولی باکتریهای اسید فاست مقدار چربی بسیار زیاد است (خصوصا در مایکوباکتریومها) و آنها مقادیر نسبتا زیادی مواد چربی ، مثل اسیدهای چرب ، مومها و چربیهای پیچیده دارند. دیواره سلولی این ارگانیسمها شبیه موم بوده بنابراین نسبتا غیر قابل نفوذ هستند. این نفوذ ناپذیری در برابر مواد ضد عفونی کننده هم به این باکتریها مقاومت بیش از حدی می دهد. همچنین آنها را در برابر خشک شدن مقاوم می کند و برای مدتهای طولانی می توانند در خلط یا دیگر مایعات خشک شده بدن باقی بمانند. ولی باسیل سل توسط پاستوریزاسیون و سترون سازی عادی توسط حرارت با آسانی از بین می رود.

رنگ‌آمیزی گرم (به انگلیسی: Gram staining) یکی از مهم‌ترین ومتداولترین روش‌های رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتری‌ها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند. رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد. دررنگ آمیزی گرم باکتری‌های گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری‌های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می‌شود. گرچه هر دو گروه یعنی باکتری‌های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت یک لایه ضخیمی‌است از پپتیدوگلیکان^*[۱]، ولی در باکتری‌های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌رسد.