─=≡Ξ║ علوم آزمایشگاهی ║Ξ≡=─
صفحات وبلاگ
نویسنده: افضل نیا - سه‌شنبه ۱٥ تیر ۱۳۸٩

تعیین و اندازه گیری غلظت یک سری از مواد سرم خون و پلاسما از روش های زیر انجام میگیرد :

1-اسپکتروفتومتر

2-نورسنجی شعله ای

3-جذب اتمی

4-الکتروفورز

یکی از روش های متداول اندازه گیری غلظت یا مقدار ماده شیمیایی استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری است.که می توان انجام واکنش را با اندازه گیری محصول واکنش بررسی کرد.

اسپکتروفتومتری

در ایام گذشته آزمایش های تشخیص پزشکی توسط پزشکان انجام می شد ( ابوعلی سینا)

در سال 1916 دکتر Todd در دانشگاه کلرادو بخش آسیب شناسی بالینی را ایجاد کرد.

دستگاه رنگ سنج Klett Biocolorimeter در دهه 1930 ابداع شد.

در دهه 1940 فوتومتر و اسپکتروفتومتر ابداع شد (روش های دستی)

در دهه 1950 برای اولین بار توسط شرکت Technicon آمریکا دستگاه اتو آنالایزر به بازار عرضه شد.

 

روش های جذب سنجی

روش های جذب سنجی یکی از قدرتمندترین و رایج ترین روش های اندازه گیری طیف وسیعی از آنالیت ها محسوب می شوند. بسیاری از دستگاه های مورد استفاده در آزمایشگاههای تشخیصی بر پایه اندازه گیری میزان جذب یا عبور انرژی تشعشعی ساخته شده اند.

اسپکتروفتومتر یا فتومتر ابزاری است که برای اندازه گیری انرژی جذبی یا عبوری نور مورد استفاده قرار می گیرد.

تشعشع الکترومغناطیسی (EMR) جریانی از انرژی است که با سرعت نور در جهان انتشار می یابد. و به صورت امواج ماکسول و جریانی از ذرات تحت عنوان فوتون وجود دارد.

طیف فرکانس های EMR از مقادیر بسیار پایین در مورد امواج رادیویی تا مقادیر بالاتر از جمله امواج فرابنفش، اشعه ایکس و اشعه گاما متفاوت است.

 

جنس و خواص نور:

نور در واقع نوعی انرژی با خاصیت دو گانه موج و ذره است.

یک موج الکترومغناطیسی از دو جزء الکتریکی و مغناطیسی با مولفه های عمود بر هم در راستای جهت انتشار تشکیل شده است.

نوری که معمولا در درجه حرارت های بالاتر از مواد ساطع می شود علاوه بر خاصیت الکتریکی دارای خاصیت مغناطیسی نیز می باشد.

قوانین بیر- لامبرت (Beer - Lamberts):

هرگاه یک نور ساده تکفام با شدت  I0عمود بر سطح تابش وارد یک محلول شفاف و یکنواخت به ضخامت L و غلظت C گردد بخشی از آن جذب شده قسمتی منعکس و قسمت دیگر از محلول عبور می کند بنابراین:

                                                     Ir+Ia+lt= I0

Ir: بخش انعکاس یافته است که میزان ناچیزی را به خود اختصاص می دهد.

Ia: بخش جذب شده که به غلظت آنالیت بستگی دارد.

It: بخش عبور کرده از محلول می باشد.

طبق نظر لامبرت هرگاه یک دسته شعاع نور تکفام (I) از محلولی به ضخامت L عبور کند کم شدن شدت نور متناسب با ضخامت محلول خواهد بود dI~L

طبق نظر بیر هرگاه یک دسته شعاع تکفام از محلولی به غلظت C عبور کند کم شدن شدت نور متناسب با غلظت آنالیت در محلول می باشد.

دستگاههایی که برای جذب سنجی به کار می روند عبارتند از: فتومترها و اسپکتروفتومترها. در فتومترها از فیلتر به عنوان تکفام ساز(Monochoromator) استفاده می شود لذا بخش محدودی از طول موج قابل دسترسی می باشد اما در اسپکتروفتومترها منشور و سیستمهای (Grating) به عنوان تکفام ساز عمل می کنند.

 

فتومترها و اسپکتروفتومترها:

اسپکتروفتومترها، تجهیزاتی است که جذب یا عبور طول موج‌های مشخصی از انرژی تابشی (نور) از یک آنالیت را در یک محلول تعیین می‌کنند. به دلیل تفاوت در تعداد و آرایش گروه‌ها، پیوندهای دوگانه اتم‌های کربن در هر مولکول نور را در طول موج‌های خاص با الگوی طیف مشخص، جذب می‌کند. بر اساس قانون بیر- لامبرت، مقدار نوری که در این طول موج مشخص جذب می‌شود مستقیما با غلظت آن نمونه شیمیایی متناسب است. اسپکتروفتومترهای مرئی و فرابنفش، رایج‌ترین دستگاه‌های جذب سنجی در مراکز تشخیصی و آزمایشگاهی است.‏

 

اسپکتروفتومتر نور مرئی

در آزمایشگاه‌ها، بخش گسترده ای از اندازه گیری‌ها بر اساس واکنش‌های جذب سنجی صورت می‌پذیرد. فعالیت اکثر آنزیم‌ها، تری گلیسیرید، کلسترول، لیپو پروتئین‌ها، قند، کراتینین، اوره و...  طیف وسیعی از آنالیت‌ها با کاربردهای بالینی و تحقیقاتی، طیف وسیعی از داروها و بخش گسترده‌ای از متابولیت‌ها با اسپکتروفتومتری قابل سنجش است. بررسی ساختمان مولکولی، شناسائی ترکیبات، مقایسه ساختمان‌ها، یافتن طول موج ماکزیمم جذب و... از دیگر کاربردهای اسپکتروفتومتری در مسائل تحقیقاتی است.‏

 

اجزا دستگاه:

شش قسمت اصلی در ساختمان اسپکتروفتومترها وجود دارد که عبارتند از:

1) منبع نور

2) مونوکروماتور

3) متمرکز کننده پرتو

4) محل نمونه

5) آشکارساز

6) دستگاه نمایش خروجی

 

1) منبع نور:

منبع نور در اثر افزایش حرارت به کمک الکتریسیته در یک لامپ تامین می شود شرایط اصلی این منبع شدت کافی، پایداری و پیوستگی اجزاء آن است. برای تامین نور مرئی از لامپ های تنگستن  (با طول موج تولیدی بین ‏nm‏ 900-330) استفاده می شود. برای تولید پرتوهای فرابنفش از لامپهای هیدروژنی یا دوتریومی (با طول موج nm 450 -200) بهره گرفته می شود.

 

2) تکفام ساز (‏(Monochromator:

این قسمت دستگاه پرتو چند فام را به پرتو تکفام تبدیل می کند این عمل ممکن است توسط منشور یا سیستم گریتینگ انجام شود. فیلترها شیشه های رنگی هستند که بخش اعظم پرتوها را جذب کرده و فقط طول موج های محدودی را عبور می دهند. فیلترها باید پرتویی را که آنالیت جذب می کند از خود عبور دهند. منشورها و سیستم گریتینگ بر اساس اختلاف ضریب شکست می توانند طول موجهایی حتی با پهنای 1/0 نانومتر تولید کنند. سیستم گریتینگ در اصل یک صفحه صیقلی است که تعداد زیادی خطوط نازک و موازی بر روی آن حک شده و کار منشور را به نحو بهتری انجام می دهد.

 

3) متمرکز کننده پرتو (Focusing device):

با ترکیبی از عدسی ها شکاف بین دو تیغه باریک فلزی و آیینه ها در مسیر پرتو تابش پرتوها مواز ی می شوند و با تنظیم عرض شکاف می توان عرض پرتو را تنظیم کرد. هر قدر عرض شکاف نور بکار رفته کمتر باشد کیفیت پرتوها بهتر خواهد بود.

 

4) محل نمونه:

 کووتها (Cuvet) قسمتی از دستگاه هستند که نمونه مورد نظر یا بلانک در آن قرار می گیرد این بخش معمولا به صورت استوانه ای یا مستطیلی بوده از شیشه کوارتز یا پلاستیک ساخته شده است.

کووتهای پلاستیکی و شیشه ای برای محدوده مرئی بکار می روند. به دلیل جذب پرتوهای با طول موج کمتر از 350 نانومتر توسط کووتهای شیشه ای برای محدوده فرابنفش از کووتهای گران قیمت کوارتزی یا سیلیسی استفاده می شود.

 

5) آشکارسازها (Detectors):

آشکارسازها دستگاههایی هستند که یک نوع از انرژی را به نوع دیگری تبدیل می کنند و معمولا به سه گروه اصلی تقسیم می شوند: 1- فتوالکتریکی 2- فتوشیمیایی 3- حرارتی. در دستگاههای اسپکتروفتومتر از آشکارسازهای فتوالکتریکی استفاده می شود. فتوسل و فتوتیوب از ساده ترین آشکارسازها می باشند.

فتوترانزیستورها و فتودیودها نیز برای این منظور استفاده می شوند. برای اندازه گیری نورهای ضعیف از (Photomultiplier Tubes) PMT بهره گرفته می شود. PMTها سریعتر جواب می دهند وعلاوه بر حساسیت بالا با دوام تر از سایر آشکارسازها می باشند.

 

6) دستگاه نمایش خروجی

این قسمت می تواند یک گالوانومتر صفحه ثبات اسیلوسکوپ یا صفحه نمایشگر کامپیوتر با نرم افزارهای متنوع باشد.

 

اسپکتروفتومتر فرابنفش (‏(Ultraviolet

ساختمانی همانند اسپکتروفتومتر نور مرئی داشته و به طول موج‌های نور فرابنفش حساس است.‏

 

اسپکتروفتومتر نشر شعله (‏(Flame

ساختمان این دستگاه شبیه اسپکتروفتومتر یا فتومتر ساده است با این تفاوت که در فتومتر، لامپ الکتریکی و در این دستگاه نور حاصل از سوختن ماده مورد آزمایش در درون شعله به عنوان منبع نوری در نظر گرفته می‌شود. در طیف سنجی نشر شعله، نور حاصل مستقیما اندازه‌گیری می‌شود.

 

اسپکتروفتومتر جذب اتمی (‏Atomic Absorption)

اسپکتروفتومترهای جذب اتمی ‏‎(AAS)‎‏ غلظت عناصر فلزی که از نظر پزشکی برای حفظ سلامتی مهم است را اندازه گیری می‌کند. در خصوص این عناصر می‌توان به کلسیم، منیزیم، مس، روی و آهن اشاره نمود. اسپکتروفتومترهای جذب اتمی همچنین برای تعیین اینکه آیا سطح درمانی داروهایی نظیر لیتیم در خون، تامین شده است یا خیر و همچنین برای آشکارسازی و تعیین کمیت سموم فلزی مورد استفاده قرار می‌گیرد.‏

تعیین طول موج ماکزیمم (maxλ)

محلول 10 میلی گرم در لیتر برومو فنول بلو را تهیه کنید. ابتدا صفر عبور را در حالی که دستگاه خالی است تنظیم کنید. در مرحله بعد به وسیله بلانک ( محلولی که تمام مواد موجود در محلول آزمایش را دارد به جز ماده مورد آزمایش) در دستگاه قرار دهید و دستگاه را روی عدد صد در صد عبور تنظیم نمائید. در این قسمت محلول مورد آزمایش را در طول موج های متفاوت بررسی نمائید و مقدار جذب نور را در آن طول موج ها به دست آورید. در نهایت منحنی مربوط به طول موج های خوانده شده را رسم کنید و حداکثر جذب خوانده شده مربوط به طول موج ها را مشخص نمائید. توجه داشته باشید که برای هر طول موج می بایست دستگاه را با بلانک صفر نمائید.



با توجه به نوع واکنش خودمان طول موج را به دستگاه می دهیم.مثلا آن را روی 350 نانومتر تنظیم می کنیم.مقداری نور از نور عبور یافته توسط دستگاه سلول فتوالکتریک جذب می شود.ونتیجه کار روی گالوانومتر ثبت می شود.مقدار عددی که به دست می آید بستگی به نوع و غلظت ماده مورد نظر دارد.

اسپکتروفتومتری بر اساس دو قانون استوار است :

قانون بیر:

اگر نور تک رنگی از محلولی جاذب و شفاف عبور کند،میزان نور جذب شده با تعداد مولکول های جسم محلول که در مسیر اشعه نوری قرار دارد متناسب است.

قانون لامبرت:

نسبت انرژی نورانی که توسط مولکول های یک ماده در لایه های مختلف محلول جذب می شود ثابت است،و به شدت نور بستگی ندارد.

هر چه طول مسیر عبور نور بیشتر باشد،جذب نور کمتر است.

میزان نور عبور یافته بر حسب درصد نور ورودی نشان داده می شود.

میزان نور عبور یلفته = % Transmitance

میزان نور جذب شده = % Absorbation

اگر هیچ مانعی جلوی عبور نور نباشد میزان عبور نور 100 % است.

اگر جسم کدری جلوی راهش باشد عبور نور 100% نیست بلکه صفر است.

دستگاه اسپکتروفتومتری هم میزان عبور نور و هم میزان جذب نور را نشان می دهد.

فرمول به دست آوردن OD به شکل زیر است:

OD=log١/T +2

اگر هیچ نمونه ای نباشد میزان نور عبور یافته 100% است در نتیجه خواهیم داشت :

OD=log1/100 +2 = log10-2+2 =-2+2 =0                →         OD=0

محلول شاهد یا   blank حاوی تمام مواد است به جز نمونه اصلی.

 

قبل از کار با دستگاه حتماٌ باید با شاهد یاblank،جذب را صفر کنیم. و بعد نمونه را داخل کووت ریخته و در محل مخصوص بگذاریم. بعد از تابش نور با طول موج معین به نمونه،%T آن روی صفحه نمایش داده می شود.هر گاه شیمیایی بر اساس ساختار خود در یک طول موج، بیشترین جذب را دارد که آن λ max می گوییم. مثلا برای پروتئین ها، 280=λmax نانومتراست.

کار با دستگاه اسپکتروفوتومتری :

پیچ 1 (از چپ) : پیچ مربوط به طول موج یاwavelength  می باشد. که با چرخاندن آن می توان دستگاه را رویmax λ مورد نظر تنظیم کرد.

پیچ 2 : از دو نوع پیچ تشکیل شده :

1)    پیچ ماکرو         2) پیچ میکرو

 

هر دوی آنها برای تنظیم کالیبراسیون یا صفر کردن دستگاه به کار می رود. پیچ ماکرو اعدادرا به طور زیاد جابه جا  می کند. و میکرو در حد صدم جابه جا می کند.

پیچ 3 : پیچ کار یاfunction است. اگر آن راروی T% (عبور یا transmittance ) تنظیم کنیم، دستگاه عبور را به ما نشان می دهد. اما اگر روی A%(جذب یاabsorbance )را ست می کنیم، جذب را اندازه می گیرد. و اگر روی Conc  Concentrationیا غلظت تنظیم کنیم، غلظت را اندازه خواهد گرفت.

و پیچ آخر مربوط به اشعه است که شامل 3 انتخاب می باشد : NLR_VIS_UV

UV که همان ultra violent یا فرابنفش است. اگر نور فرابنفش نیاز باشد روی آن ست می شود.(کمتر از 380nm)

VIS که همان visible یا نور مرئی است. اگر نمونه طبیعی باشد روی آن  ست می شود (690nm_380)

NIR که همان near infra ned یا فروسرخ است. بالاتر ازnm 690 است.

 

 


نویسندگان وبلاگ:
مطالب اخیر:
دوستان من:
کدهای اضافی کاربر :