─=≡Ξ║ علوم آزمایشگاهی ║Ξ≡=─
صفحات وبلاگ
نویسنده: افضل نیا - پنجشنبه ٢۸ دی ۱۳٩۱

1-        هدف: 

تهیه محیط های کشت استریل جهت رشد و جداسازی سویه های میکروبی از نمونه های مربوط به بیمار

2-      تعاریف و اصطلاحات:

شرایط آسپتیک: ایجاد شرایط سترون با کار کردن در کنار شعله و رعایت نکات لازم جهت جلوگیری از آلودگی نمونه

3-      شرح اقدامات:

3-1)  آب:

آب مورد استفاده باید دارای کیفیت مناسب باشد، یعنی عاری از موادی باشد که می توانند از رشد میکروارگانیسم ها جلوگیری کنند (یونهای فلزی سمی مثل مس) یا در شرایط آزمایش بر رشد آنها تاثیر بگذارند. آب خوب و تازه باید از راه تقطیر یا دیونیزاسیون تهیه شود. برای نگهداری آب مقطر باید از ظروفی استفاده شود که از مواد خنثی تهیه شده اند (شیشه خنثی، پلی اتیلن و غیره). ضریب هدایت آب باید کمتر از μs 15 باشد.pH  آب معمولا" کنترل نمی  شود مگر آنکه مشکلی در pH محیط های کشت تهیه شده بوجود آید. ممکن است آب دارای مقادیر زیادی میکروارگانیسم باشد، بنابراین توصیه می شود از آبی استفاده شود که تعداد میکروارگانیسم آن کم است .


3-2)  توزین محیط کشت و افزودن آب:

طبق دستورالعمل تهیه محیط کشت که بر روی قوطی نصب گردیده است، مقدار مناسبی از پودر محیط کشت را با دقت وزن نمایید. ظرف محیط کشت را دور از کوران هوا و رطوبت باز کنید. از استنشاق پودرها به خصوص آنهایی که دارای مواد سمی هستند و تماس طولانی مدت آنها با پوست اجتناب کنید. پودر را به سرعت، به دقت و بدون ایجاد توده ای از غبار وزن کنید. هرچه زودتر درب ظرف را ببندید.

نصف حجم آب مورد نیاز را داخل ظرف بریزید. سپس مقدار وزن شده محیط کشت را به آن اضافه نمایید. برای چند دقیقه به تندی تکان دهید. باقیمانده آب را به دیواره ظرف بریزید تا ذرات محیط کشت چسبیده به دیواره نیز وارد محلول شوند. این مرحله بسیار مهم است، چون پودر خشک محیط کشت در بالای سطح آب، ممکن است در اتوکلاو استریل نشود و منبع آلودگی گردد.

3-3)  حل کردن محیط کشت:

محیط های کشت  بدون آگار، معمولا با تکان دادن آهسته و ملایم حل خواهند شد. اما محیط های کشت حاوی آگار باید قبل از حرارت دادن به مدت چند دقیقه با آب مخلوط شوند. سپس حرارت داده شوند تا آگار قبل از اتوکلاو کردن، حل شود. محیط های کشت را بجوشانید بدون آنکه بسوزند.

محیط های کشتی که نباید اتوکلاو شوند، بعد از این مقدار حرارت دادن، برای تقسیم داخل پلیت ها یا ظروف دیگر آماده خواهند بود. اکثر محیط های کشت به استریلیزاسیون نهایی (در دمای C °121 به مدت 15 دقیقه) نیاز خواهند داشت.

3-4)  استریلیزاسیون:

بعضی از محیط های کشت به استریلیزاسیون با اتوکلاو احتیاجی نداشته و با جوشاندن استریل می شوند که دستور ساخت آنها بر روی برچسب قوطی محیط کشت قید گردیده است. استریلیزاسیون سایر محیط های کشت توسط حرارت مرطوب یا صافی غشایی انجام می گردد که این موارد نیز بر روی بر چسب قوطی محیط کشت قید گردیده است.

الف) استریلیزاسیون با حرارت مرطوب:

استریلیزاسیون محیط کشت تا حجم یک لیتر، در اتوکلاو به مدت 15 دقیقه  و در دمای C °121 (فشار 2/1 کیلوگرم بر سانتی متر مربع) انجام می گیرد. برای حجم های بیشتر از یک لیتر باید چرخه استریلیزاسیون را بطور مناسب تغییر داد. اما چون  اکثر مشکلات در استریلیزاسیون محیط های کشت وقتی رخ میدهد که مقادیر بیشتر از دو لیتر محیط کشت باید استریل شود، لذا توصیه می شود که مقادیر زیاد محیط کشت را در حجم های کوچکتر تقسیم نمایید.

ب) استریلیزاسیون با صافی غشایی:

از صافی غشایی برای استریل کردن محیط های کشت و ترکیبات حساس به حرارت استفاده می شود. استریلیزاسیون بوسیله صافی غشایی تحت شرایط خلاء یا افزایش فشار انجام می پذیرد. از غشاء ها و صافیهای با قطر منفذ 22/0 یا 45/0 میکرومتر استفاده نمایید. این فیلترها باید قبل از استفاده، در اتوکلاو استریل شوند. در مورد غشاء ها و صافیهایی که در بسته بندیهای استریل به فروش می رسند، به دستورالعمل سازنده مراجعه نمایید. قسمت های مختلف دستگاه صافی را با صافی یا بدون صافی در اتوکلاو به مدت 15 دقیقه در دمای C  °121 استریل نمایید.

3-5)  آماده سازی جهت مصرف:

بعد از استریلیزاسیون، زمانیکه دمای محیط کشت به حدود  C °50  رسید، با رعایت شرایط آسپتیک در ظروف نهایی تقسیم نمایید. هیچ وقت محیط کشت را در دمای بالاتر از C °50 تقسیم نکنید. مکمل های حساس به گرما و حرارت باید بعد از این که دمای محیط کشت به حدود C °50 رسید، به آن اضافه شوند. دمای مکمل (ساپلمنت) قبل از این که به محیط کشت اضافه شود، به دمای اتاق برسد. سپس مکمل را با رعایت شرایط آسپتیک به محیط کشت اضافه نموده، خوب مخلوط کنید.

3-6)  توزیع:

سپس در ظروف نهایی که از قبل استریل شده اند، تقسیم نمایید.

3-7)  اندازه گیری و تنظیم pH:

محیط های کشت دهیدراته اگر بطور مناسب تهیه شوند نیازی به تنظیم pH ندارند.pH  نهایی محصول استریل شده را می توان روی پلیت یا بطری اندازه گیری کرد، اما باید آنها را بعد از سنجش pH دور ریخت. بنابراین بعد از استریل شدن و خنک شدن محیط کشت تا دمای C °25، مقدار  pHرا در حد مورد نظر (2/0 ±) تنظیم نمایید. تنظیم pH معمولا با استفاده از هیدروکسیدسدیم 40 گرم در لیتر (تقریبا" یک مولار) و یا با استفاده از اسید کلریدریک 5/36 گرم در لیتر (تقریبا" یک مولار) انجام می شود.

 

دستورالعمل تهیه انواع محیط های کشت مصرفی در آزمایشگاه میکروب شناسی، به شرح ذیل می باشد:

روش تهیه انواع محیط های کشت دهیدراته و استریلیزاسیون آنها

روش کار بر اساس دستورالعمل موجود بر روی قوطی های حاوی انواع محیط های کشت
می‌باشد. روش استریلیزاسیون نیز بر روی برچسب دستورالعمل تهیه محیط کشت درج گردیده است. این دستورالعمل ها بر حسب نوع محیط کشت و کارخانه تولیدکننده، متفاوت است.

محیط های کشت دهیدراته شامل:

آگار بی هوازی، بلاد آگار((B.A، برین هارت آگار و براث (BHB/BHA)، بایل اسکولین آگار، بیسموت سولفیت آگار، بروسلا مدیوم، کوکدمیت براث، کمپیلوباکتر سلکتیو آگار، کری بلر، کازو آگار و براث (TSA/TSB)، CTA مدیوم، DNase تست آگار، EMB آگار، هموفیلوس سلکتیو آگار، هکتون انتریک آگار، کلایگلر آیرون آگار (KIA)، لایزین دکربوکسیلاز سولفیدراز مدیوم (LDS)، لوون اشتاین جنسن مدیوم، لوفلر بلاد سرم، لایزین آیرون آگار، مولر هینتون آگار و براث (MHA/MHB)، MRVP براث، مانیتول سالت آگار، مک کانکی آگار، مالونات براث، نوترینت آگار و براث (N.A/N.B)، نیترات براث، اورنی تین دکربوکسیلاز آرژینین دهیدرولاز تست براث، OF بازال مدیوم، پپتون واتر، فنیل آلانین آگار، فنل رد براث و آگار، پپتون آگار، سیمون سیترات آگار، SIM مدیوم، سالمونلا شیگلا آگار (S.S)، سلنیت براث، تریپل شوگر آیرون آگار (TSI)، TCBS آگار، تایو گلیکولات براث، اوره آگار و براث، XLD آگار و سایر محیط های کشت دهیدراته که در دفتر راهنمای محیط های کشت ثبت شده اند می باشد.

روش تهیه محیط کشت ژلاتین (ترکیبی)

پیتون=  g5   

Beef Extract = g 3

ژلاتین= g 120

مقادیر فوق را به cc1000 آب‌ مقطر اضافه کرده و در بن ماری جوش قرار دهید تا کاملاً حل شوند (از حرارت دادن این محیط کشت بر روی شعله پرهیز کنید). سپس در اتوکلاو به مدت 15 دقیقه و دمای oC121 در فشار 15 پوند ( Lb15) استریل ‌نمایید. سپس در لوله تقسیم کرده و PH  محیط کشت را به 8/6 برسانید

روش تهیه محیط کشت آب پپتونه  قلیایی یا APW (ترکیبی)

پیتون= g10

کلرور سدیم (Nacl)= g10

آب‌مقطر=cc 1000

سپس pH را به 9-6/8 برسانید و در شرایط 15 دقیقه, فشار Lb 15 در اتوکلاو قرار داده و استریل نمایید. دما نیز  oC121 است. ( برای تنظیم از سودN  1 استفاده کنید)

روش تهیه محیط کشت حاوی گلیسرین جهت دیپ فریز

از محیط کشت پایه: محیطTSB  (Trypticase Soy Broth) یا محیط کشت BHB                                                     (Brain Heart Infusion Broth) استفاده کنید. به میزان 15% گلیسرین به محیط پایه اضافه نمایید. به خوبی تکان ‌دهید تا محلول یکنواختی حاصل شود. سپس در مقادیر کم ( ml2-1) در لوله های درپیچ دار تقسیم نموده و در شرایط  oC121 ، 15 دقیقه و فشار  Lb15 اتوکلاو نمایید.

روش تهیه محیط کشت مصرفی در لیوفیلیزاسیون(ترکیبی)

ژلاتین= g100 

اینوزیتول = g50

نوترینت براث=  g25

مقادیر فوق را به cc1000 آب‌مقطر اضافه کرده و در بن ماری جوش حرارت ‌دهید تا کاملاً حل شوند (از قرار دادن در حرارت مستقیم شعله خودداری شود). در لوله تقسیم کرده و در شرایط فشار  Lb15, دمای oC 121 و مدت زمان 15 دقیقه استریل نمایید.

روش تهیه محیط کشت  NaCl5/6%  (براث/ آگار)

محیط پایه همان محیط برین هارت اینفیوژن براث/آگار است. از آنجا که این محیط کشت حاوی 5/0% نمک می‌باشد، بنابراین 6% نمک به این محیط پایه اضافه نمایید تا مقدار 5/6% نمک حاصل شود. شرایط استریلیزاسیون همان دمای oC121، فشار  Lb15 و زمان 15 دقیقه می‌باشد.

روش تهیه انواع قندها:    

محلول 10% از انواع قندها تهیه نمایید (قند= g10 و آب‌مقطر= cc100)

روش استریلیزاسیون قندها استفاده از فیلتراسیون می‌باشد. در غیر اینصورت می توان همه انواع قندها را در فشار  Lb5 به مدت 5 دقیقه استریل نمود.

اگر بخواهید قندها را از هم تفکیک نمایید، شرایط استریلیزاسیون برای انواع لاکتوز، مالتوز، گزیلوز، سالیسین، سوکروز، ترهالوز و آرابینوز شامل فشار Lb 15، دمای  oC121 به مدت 3 دقیقه و شرایط استریلیزاسیون برای سایر قندها شامل فشار  Lb12-10، دمای  oC118-116 و زمان 15 دقیقه می باشد.

نویسندگان وبلاگ:
مطالب اخیر:
دوستان من:
کدهای اضافی کاربر :