─=≡Ξ║ علوم آزمایشگاهی ║Ξ≡=─
صفحات وبلاگ
نویسنده: افضل نیا - سه‌شنبه ۱۸ خرداد ۱۳۸٩

از آنجاییکه ریبوزوم ها دارای خاصیت رنگ پذیری با رنگهای ویژه ای همچون بریلیانت کریزن بلو(brilliant cresyl blue) و متیلن بلوی جدید (new methylene blue) بوده،و به شکل رسوبات دانه ای و یا رشته ای درون یاخته سرخ شکل می گیرند، از رنگهای فوق جهت تعیین درصد آنها داستفاده میشود.

              

چون ریبوزوم رتیکولوسیت تنها به صورت زنده و بدون مرگ و یا ثابت شدن سلول (فیکساسیون) یا این رنگها پذیرفته و تشخیص داده میشود، به آنها رنگهای حیاتی می نامند.تعداد ریبوزومها و در نتیجه شدت رنگ پذیری عمدتا در رتیکولوسیتهای نارس شدت بیشتری داشته و هر چه سلول بالغتر شود ، از تعداد ریبوزومها و در نتیجه شدت رنگ پذیری آن کاسته میشود.

اگر خون را ابتدا به روش رنگ آمیزی حیاتی رنگ نموده و پس از کشیدن لام با الکل متانول فیکس و سپس به روش رنگهای رومانوفسکی ، رنگ آمیزی نماییم ،رتیکولوسیت ها به صورت یاخته های سرخ بازوفیلی رنگ مشاهده خواهند شد ، که در درون آنها شبکه ریبوزومی نیز وجود دارد.

قضاوت و تصمیم اینکه چه چیزی رتیکولوسیت است ، در زیر میکروسکوپ ، کمی مشکل است چرا که اغلب رتیکولوسیت های بالغ حاوی تعداد بسیار اندکی ریبوزومهای رشته ای و یا نقطه ای هستند.

                          

بنا بر تجربه پاره ای از محققین ، رنگ متیلن بلوی جدید ارجح تر از بریلیانت کریزل بلو بوده و ریبوزوم ها را با شدت و یکنواختی بیشتری رنگ می نماید.

به نظر میرسد آزورB خالص ، جانشین مناسبی برای متیلن بلو جدید باشد ، چرا که فاقد رسوب بوده ، غلظت رنگ مصرفی و مراحل رنگ پذیری هر دو رنگ یکسان است.

محلول رنگ آمیزی

1گرم متیلن بلو را در 100 میلی لیتر محلول سیترات در سالین (1حجم سیترات سدیم 30 گرم در لیتر ، در 4 حجم از محلول 9 گرم در لیتر نمک طعام ) حل کرده و سپس مخلوط حاصل را صاف کنید. رنگ آماده مصرف است.

روش کار

2 یا3 قطره از رنگ متیلن بلو را با پیپت پاستور ، داخل لوله ای شیشه ای یا پلاستیکی به ابعد 75*10 میلی متر ریخته و 2 تا 4 برابر حجم رنگ به آن خون حاوی ضد انعقاد اضافه و سپس آنها را مخلوط کنید.لوله را در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 15 تا 20 دقیقه نگهداری کنید.

با تکان دادن آرام لوله ، گلبولهای سرخ را مجددا به حالت سوسپانسیون در آورده و با روش متداول گسترش هایی بر روی لام تهیه کنید.بعد از خشک شدن ، گسترش ها را بدونثابت کردن و رنگ آمیزی دیگری در زیر میکروسکوپ بررسی کنید.

چون حجم دقیق خون که به محلول رنگ اضافه گشته ، شمارش یاخته ها یسرخ را تحت تاثیر قرار میدهد، مقدار زیادتری از خون آنمیک و مقدار کمتری از خون در موارد پلی سیتمی را نسبت به خون نرمال باید به محلول رنگی اضافه نمود.

در  یک لام خوب تهیه شده ، ریبوزوم رتیکولوسیت ها به رنگ آبی در آمده و سلول های بالغ به صورت سایه های کمرنگ آبی مایل به سبز ، به صورت پراکنده رنگ می شوند.

هر چند لامهای تهیه شده به روش متیلن بلوی جدید نیازی به رنگهای زمینه ای ندارند ، ولی به غلت رسوب رنگهای زمینه ای احتمال اشتباه با این روش زیاد است.

از طرف دیگر اگر بعد از تهیه گسترش ، لام را ثابت و سپس به روش یکی از رنگهای گروه رومانوفسکی رنگ آمیزی نماییم  ، اجسام هاینز به علت بی رنگ شدن توسط الکل مشاهده نخواهند شد ، هر چند که در مرحله اول موجب عدم گزارش اشتباه آنها می شود ولی واقعیت این است که اگر در لام رتیکولوسیتی  به وجود اجسام هاینز مشکوک شدید می توانید با این روش و مقایسه درصد یاخته های سرخ حاوی گرانول قبل و بعد از رنگ آمیزی ثانویه ، پی به وجود و درصد آنها در خون محیطی بیمار ببرید.

شمارش رتیکولوسیت ، حداکثر تا 24 ساعت بعد از گرفتن نمونه قابل قبول است ،ولی عمدتا باید دانست که با گذشت زمان و ماندن نمونه در حرارت آزمایشگاه ، با بلوغ رتیکولوسیتها و تبدیل شدن آنها به یاخته های سرخ بالغ، درصد رتیکولوسیت ها کاهش یافته و در خون فرد نرمال بعد از 24 ساعت به صفر میرسد.

شمارش و گزارش درصد رتیکولوسیت ها

برای شمارش و تعیین درصد رتیکولوسیت ها ، محلی از لام را باید انتخاب نماییم که اولا سلول های متلاشی نشده و ثانیا یاخته ها به خوبی رنگ پذیرفته باشند.فی المثل انتخاب سر لام به خاطر آنکه معمولا سلول ها پاره گشته اند مناسب نمی باشند.هر چند سلول ها روی هم قرار نگرفته و جداجدا مشاهده می شوند ولی تهیه گسترش بسیار نازک ، توصیه نمی شود.

برای تعیین درصد رتیکولوسیت ها از عدسی شیئی روغنی ( درشت نمایی100=oil-immersion) استفاده می شود. در صورت امکان در این راستا از عدسی های چشمی دارای دیافراگم قابل تنظیم در دسترس نبود،به راحتی میتوانید از یک قطعه کوچک کاغذ یا مقوای دایره ای شکلی که در مرکزش مربع کوچکی به ابعاد 4*4 میلی متر بریده شده است استغاده نمایید.

با قرار دادن این قطعه کاغذی ، داخل عدسی چشمی خواهید توانست به راحتی و با دقت زیادی ، تک تک سلول ها را بررسی نموده و رتیکولوسیت بودن یا نبودن آنها را ارزیابی کنید.

تعداد گلبول های سرخی که باید مورد ارزیابی قرار بگیرن ، رابطه ی غیر مستقیمی با تعداد رتیکولوسیت ها دارد.

فی المثل اگر تعداد رتیکولوسیت های بیمار اندک بود ، باید تعداد بیشتری از گلبول ها را مورد بررسی قرار داد.

برای درصدهای کمتر از 10 باید با بررسی میدان های مختلف حد الاقل 100 رتیکولوسیت را مشاده و سپس با بستن تناسب مشخص سازیم که به ازای 100 یاخته سرخ چه تعداد رتیکولوسیت مشاهده شده است.فرض نمایید تعداد رتیکولوسیت های مشاهده شده در 150 میدان میکروسکوپ 100 عدد و تعداد کل یاخته های سرخ موجود چه رتیکولوسیت و چه اریتروسیت بالغ در 15 میدان میکروسکوپ 300 عدد باشد.بنابر این:

تعداد گلبولهای سرخ موجود در 150 میدان   300*10=3000


تعداد رتیکولوسیت ها                   تعداد کل یاخته های سرخ

       100                                               3000

          ایکس                                           100 

ایکس=تعداد مطلق رتیکولوسیت ها=3/3%

هر چند در موارد کاهش شدید رتیکولوسیت ها ( رتیکولوسیتوپنی شدید=reticulocytopenia severe)

این طریق شمارش بسیار وقت گیر است ولی حد الاقل استفاده از یک شمارشگر دستی قادر است آزمایش کننده را تا حد زیادی کمک نماید.

در مواردی که درصد رتیکولوسیت ها بیشتر از 10 است ، تعداد یاخته های سرخ موجود ( چه رتیکولوسیت و چه اریتروسیت بالغ)در تعداد بیشتری از میادین باید مورد ارزیابی قرار گیرد.فی المثل اگر ، تعداد رتیکولوسیت های مشاهده شده در 25 میدان میکروسکوپی به 100 عدد رسیده باشد و از ظاهر میکروسکوپی لام نیز مشخص باشد که در درصد رتیکولوسیت های آن بیشتر از 10 درصد است ، تعداد کل یاخته های سرخ را باید در بیشتر از 15 میدان شمارش نمایید.

مثلا اگر در مثال فوق تعداد یاخته های سرخ موجود در 50 میدان میکروسکوپ  1500 عدد باشد بنابر این :

تعداد رتیکولوسیت های 50 میدان       100*2=200

تعداد رتیکولوسیت ها             تعداد کل یاخته های سرخ

     200                                            1500

      ایکس                                          100

ایکس=درصد مطلق رتیکولوسیت ها =13/3%

رنگ آمیزی و گسترش صحیح،بدون شک موجب نتایج دقیق تری خواهد شد.عوامل دیگری که روی دقت آزمایش تاثیر دارند،تیزبینی،صبر و حوصله شمارش کننده می باشد،هر چند که کیفیت و قدرت تفکیک میکروسکوپ نیز حائز اهمیت است.نکته جالب توجه آن است که بر طبق تحقیقات صورت گرفته ، مشخص شده دقیق ترین شمارش ها توسط افراد با وجدانی انجام گشته که اطلاعاتی از میزان مورد انتظار رتیکولوسیت ها ، نداشته اند.

تشخیص این مهم که کدام سلول رتیکولوسیت بوده و کدام نیست ،ممکن است برای افراد نا آشنا مشکل باشد،چرا که رتیکولوسیت های بالغ تر تنها حاوی تعداد اندکی نقاط و یا رشته های رنگ گرفته ، ریبوزومی هستند.


نویسندگان وبلاگ:
مطالب اخیر:
دوستان من:
کدهای اضافی کاربر :